一株溶藻細(xì)菌的分離鑒定及溶藻特性研究

鐘鴻干+李培+孫楊

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.02.001

摘 要：從三亞市大東海分離出1株有較強(qiáng)溶藻活性的細(xì)菌，命名為L-D1，并對該菌株進(jìn)行形態(tài)和生理生化鑒定。L-D1的菌懸液對中肋骨條藻的生長有很強(qiáng)的抑制作用。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，L-D1是通過直接和間接的方式共同作用影響中肋骨條藻的生長的；L-D1的溶藻效果在溫度為25 ℃時優(yōu)于其他溫度，鹽度為20‰時優(yōu)于其他鹽度，全黑暗條件下的溶藻效果優(yōu)于其他光照條件下的。

關(guān)鍵詞：溶藻細(xì)菌；中肋骨條藻；溶藻；赤潮

隨著水體富營養(yǎng)化的不斷加劇，海洋開發(fā)活動的日益增加，世界航運(yùn)的不斷發(fā)達(dá)，以及沿海工業(yè)、農(nóng)業(yè)、海洋養(yǎng)殖業(yè)以及旅游業(yè)的快速發(fā)展，導(dǎo)致赤潮發(fā)生的頻率增高、范圍擴(kuò)大，已經(jīng)成為一種全球性的海洋災(zāi)害[1]。引發(fā)赤潮的生物有很多種，其中海洋浮游微藻是引發(fā)赤潮的主要生物。在四千多種海洋浮游微藻中有260多種能形成赤潮，其中有70種產(chǎn)生毒素[2]。溶藻細(xì)菌可以通過直接或間接的方式，抑制藻類生長或殺死藻類，而且具有經(jīng)濟(jì)、安全、特異、特效、維持水體生態(tài)平衡等特點(diǎn)[3]。本研究通過對固體平板溶藻方法的改良，從三亞大東海分離出一株對中肋骨條藻具有溶藻效果的細(xì)菌，命名為L-D1，同時針對L-D1溶藻的特性，溶藻的方式以及環(huán)境因子對其溶藻效果的影響進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 藻種來源及培養(yǎng)

研究所用中肋骨條藻（Skeletonema costatum）為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。藻種經(jīng)活化后，在25 ℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx及光暗比為12 h∶12 h條件下培養(yǎng)。

液體培養(yǎng)基配方[4]如下：NaNO3 75 mg，NaH2PO4?H2O 5 mg，Na2SiO3?9H2O 20 mg，Na2EDTA 4.36 mg，F(xiàn)eCl3?6H2O 3.16 mg，CuSO4?5H2O 0.01 mg，ZnSO4?7H2O 0.023 mg，CoCl2?6H2O 0.012 mg，MnCl2?4H2O 0.18 mg，Na2MoO4?2H2O 0.07 mg，維生素B1 0.1 mg，維生素B12 0.5 mg，生物素 0.5 mg，陳海水 1 L。

固體培養(yǎng)配方如下：1 000 mL 上述液體培養(yǎng)基中加入10～15 g瓊脂。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)基

細(xì)菌固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，肉浸粉 3 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g，1 000 mL 蒸餾水。

細(xì)菌液體培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g，牛肉粉 3 g，NaCl 5 g，1 000 mL 蒸餾水。

1.3 樣品采集

2012年于海南省三亞市大東海采集海水用于溶藻細(xì)菌的分離。所采集樣品在低溫下保存并在4 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。

2 方法

2.1 溶藻細(xì)菌的分離

將采集的海水水樣用無菌陳海水進(jìn)行梯度稀釋后，采用涂布法獲得細(xì)菌單菌落。然后進(jìn)行溶藻細(xì)菌的篩選，把冷卻至45 ℃以下含有中肋骨條藻的固體培養(yǎng)基快速搖勻倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，用無菌打孔器將從海水中分離得到的細(xì)菌單菌落打下，并倒置在中肋骨條藻平板上，在26 ℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx下培養(yǎng)，以無菌的營養(yǎng)瓊脂塊作為對照，每天觀察細(xì)菌單菌落周圍是否出現(xiàn)抑藻圈。

將產(chǎn)生抑藻圈的瓊脂塊取下，采用平板劃線法進(jìn)行該菌的純化，并觀察記錄菌落形態(tài)特征。將純化的菌株接種于試管斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 溶藻細(xì)菌的鑒定

對分離出的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、氧化酶，接觸酶，葡萄糖、甘露醇發(fā)酵，硝酸鹽還原，MR-VP，7.5% NaCl培養(yǎng)液等生理生化鑒定，其方法參照文獻(xiàn)[5]。

2.3 溶藻細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的溶藻效果

在液體培養(yǎng)基中將L-D1培養(yǎng)48 h后，加入到藻液中，進(jìn)行液體溶藻試驗(yàn)。按照1∶9的比例將菌液加入到中肋骨條藻藻液中，連續(xù)7 d觀察藻液變化情況。

2.4 溶藻細(xì)菌溶藻方式的探討

按照1∶9的比例在中肋骨條藻藻液中加入以下細(xì)菌培養(yǎng)物：細(xì)菌原液、高溫高壓處理后的菌液、高速離心沉降后的菌液、0.22 μm膜過濾后的菌液，同時設(shè)對照組。7 d后，分別測試它們對中肋骨條藻葉綠素a含量的影響。

2.5 環(huán)境因子對其溶藻效果的影響

光照是藻類生長繁殖的重要生態(tài)因子，本研究選擇了全黑暗、光循環(huán)、全光照三個光照條件，以探討光照對L-D1溶藻效果的影響。每天定時取樣，以葉綠素a含量變化為檢測指標(biāo)。

溫度是影響生物體生長的重要環(huán)境因子，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃，5個溫度梯度進(jìn)行溶藻實(shí)驗(yàn)，以研究溫度對溶藻細(xì)菌L-D1的影響。

鹽度是水生生物生存的限制因子，本研究分別以鹽度為15‰、20‰、25‰、30‰、35‰，5種不同鹽度的培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)菌溶藻實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 溶藻細(xì)菌的篩選

在中肋骨條藻平板中（如圖1），帶有細(xì)菌菌落的瓊脂塊（b）周圍出現(xiàn)了直徑約為20 mm的抑藻圈，而對照瓊脂塊（a）周圍的藻生長正常。

3.2 溶藻細(xì)菌生理生化鑒定結(jié)果

菌株L-D1為革蘭氏陽性菌，菌落呈圓形、乳白色半透明、表面光滑，在液體培養(yǎng)基里呈直桿狀，具芽孢，可運(yùn)動帶鞭毛。氧化酶陰性，接觸酶陽性，發(fā)酵葡萄糖只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，可利用甘露醇產(chǎn)酸，可還原硝酸鹽，MR陽性，VP陰性，在7.5%的NaCl中不能生長。

a為無菌瓊脂塊作對照，b為帶菌落的瓊脂塊產(chǎn)生的抑藻圈

圖1 溶藻細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中對中肋骨

條藻的溶藻效果

3.3 溶藻細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中對中肋骨條藻生長的影響

培養(yǎng)7 d后，與對照組相比，加入溶藻細(xì)菌的中肋骨條藻藻液出現(xiàn)大量土黃色絮凝狀沉淀（如圖2），顯微鏡觀察大量藻細(xì)胞凝聚集成團(tuán)狀，且藻細(xì)胞周圍聚集了大量的細(xì)菌，只有極少數(shù)的藻細(xì)胞單個獨(dú)立存在。因此，溶藻細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中也能抑制中肋骨條藻的生長。

圖2 添加菌懸液7d后，中肋骨條藻液照片

3.4 溶藻細(xì)菌的溶藻方式

溶藻細(xì)菌菌液經(jīng)高溫處理、高速離心沉降、0.22 μm濾膜過濾后，加入到中肋骨條藻的藻液中進(jìn)行共同培養(yǎng)，均可顯著抑制其葉綠素a的含量（P＜0.05），其中細(xì)菌原液對中肋骨條藻葉綠素a的合成抑制作用最強(qiáng)，其葉綠素a含量比對照組減少了73.80% ，表明菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a含量的影響是通過直接和間接方式共同作用的。經(jīng)高溫處理后的菌液對葉綠素a的含量仍有較強(qiáng)的抑制作用，表明菌株L-D1分泌的代謝物為非蛋白類物質(zhì)，如圖3所示。

D1菌原液組，D2高溫滅菌組，D3離心沉降組，D4濾膜過濾組

圖3 經(jīng)不同方式處理后的菌液對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

3.5 環(huán)境因子對其溶藻效果的影響

3.5.1 光照對細(xì)菌溶藻效果的影響 三個光照條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。6 d后，全黑暗條件下藻的葉綠素a含量最少，為0.019 mg/L，與其相應(yīng)的對照組比減少了67.74%；全光照條件下藻的葉綠素a含量最多，為0.064 mg/L。如圖4所示，Duncan多重比較結(jié)果表明，全黑暗條件下溶藻細(xì)菌對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖4 6 d后，不同光照條件下溶藻細(xì)菌對中肋骨

條藻葉綠素a含量的影響

3.5.2 溫度對細(xì)菌溶藻效果的影響 不同溫度條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。25 ℃時中肋骨條藻葉綠素a的含量為0.049 mg/L，與30、35 ℃時相比葉綠素a的含量分別減少了75.62%、85.92%。如圖5所示，通過Duncan多重比較，表明溶藻細(xì)菌在25 ℃下對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖5 6 d后，不同溫度條件下溶藻細(xì)菌對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

3.5.3 鹽度對細(xì)菌溶藻效果的影響 不同鹽度條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。鹽度為20‰時中肋骨條藻葉綠素a的含量為0.119 mg/L，與鹽度為15‰、30‰、35‰時相比葉綠素a的含量分別減少了24.7%、30.41%、36.02%。如圖6所示，溶藻細(xì)菌在鹽度為20‰時對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖6 6 d后，不同鹽度條件下溶藻細(xì)菌對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

4 討論

作為防治赤潮的一種可能性生物，溶藻細(xì)菌的研究不但具有重要的理論價值還具有潛在的應(yīng)用價值。國內(nèi)外對于溶藻細(xì)菌的分離有多種途徑，裴海燕等[6] 利用海綿固定化微生物系統(tǒng)分離出了對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）、小球藻（Chlorella sp.）及柵藻（Scenedesmus sp.）具有較強(qiáng)溶解效果的細(xì)菌菌株。曹賓霞等[7]用試管法篩選對塔瑪亞歷山大藻具有溶藻能力的細(xì)菌。這兩種方法的工作量都較大。王海玉等[8]分離出一株紅色溶藻細(xì)菌對銅綠微囊藻有很強(qiáng)的溶解效果，該方法采用了果膠分解菌的培養(yǎng)基，所以對溶藻細(xì)菌的生存環(huán)境具有一定限制，在實(shí)際應(yīng)用中存在局限。本實(shí)驗(yàn)通過對固體平板溶藻法的改良，首先通過涂布法獲得不同細(xì)菌的單菌落，然后利用這些單菌落進(jìn)行固體培養(yǎng)基溶藻試驗(yàn)，選擇產(chǎn)生抑藻圈的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)基溶藻試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證其溶藻的效果。該方法分離周期短且操作簡單，是一種分離篩選溶藻細(xì)菌的有效途徑。

溶藻細(xì)菌主要通過以下方式實(shí)現(xiàn)溶藻效果：一是與藻細(xì)胞競爭營養(yǎng)物質(zhì)；二是分泌胞外物質(zhì)如蛋白質(zhì)、抗生素等作用于藻細(xì)胞，導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡；三是寄生于藻細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖，從而使得藻細(xì)胞裂解死亡[9]。在以往的研究中，大部分分離篩選得到的溶藻細(xì)菌屬于間接性溶藻，只有少部分屬于直接性溶藻[10]。為了探討菌株L-D1對中肋骨條藻的溶解方式，將不同方式處理的菌懸液按照一定比例加入到中肋骨條藻液體培養(yǎng)基中，均能抑制藻細(xì)胞的生長，其中菌原液對藻細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，經(jīng)濾膜過濾的菌液和經(jīng)離心沉降的菌液對藻細(xì)胞有一定的抑制作用，而經(jīng)高溫處理后的菌液仍有較強(qiáng)的溶藻活性，說明細(xì)菌分泌物具有很強(qiáng)的溶藻效果，且熱穩(wěn)定性較高。結(jié)果表明菌株L-D1的作用方式以間接溶藻為主，同時進(jìn)行直接溶藻。

光照主要通過光合作用影響藻細(xì)胞的生長，而對細(xì)菌的影響不大。很多研究表明在無光照的條件下，藻細(xì)胞的光合作用幾乎無法進(jìn)行，此時藻細(xì)胞很容易受到溶藻細(xì)菌的攻擊而死亡[11]。本研究得出的結(jié)論與其它研究一致，即全黑條件下菌株L-D1對中肋骨條藻生長的抑制效果最強(qiáng)。在光循環(huán)條件、全光條件下菌株L-D1的溶藻效果依次減弱。在全黑暗條件下，中肋骨條藻的光合作用無法進(jìn)行，而菌株L-D1的增殖卻不受影響。隨著培養(yǎng)時間的增加，溶藻細(xì)菌的數(shù)量逐漸超過藻細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)出較強(qiáng)的溶藻效果。而在全光照條件下，中肋骨條藻由于光適應(yīng)周期較長，所以藻細(xì)胞可以持續(xù)生長。其增長速度不斷提高，而細(xì)菌增長速度基本不變，所以藻細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)增長趨勢。

如果某一溫度有利于溶藻細(xì)菌的生長，而對藻細(xì)胞的生長影響很小或者具有一定抑制作用，那么將呈現(xiàn)出明顯的溶菌效果，反之，呈現(xiàn)出弱的溶藻效果或無溶藻效果[12]。由于中肋骨條藻為廣溫的典型代表，其在溫度較高時仍能保持很高的生長率。溫度在30～35 ℃時藻細(xì)胞的生長率超過菌株L-D1的，呈現(xiàn)出較弱的溶藻效果；而溫度在20～25 ℃時菌株L-D1的生長率超過藻細(xì)胞的，則呈現(xiàn)出較強(qiáng)的溶藻效果。

微藻和細(xì)菌都有最適生長鹽度，當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谠擕}度時，對其生長都會產(chǎn)生影響[13]。中肋骨條藻作為廣鹽的典型代表，鹽度的變化對其生長的影響并不明顯，而對菌株L-D1的影響則比較大。在鹽度為20‰～25‰時，其比較適宜菌株L-D1的生長，故溶藻效果比較明顯。而鹽度為15‰、35‰時，其不適宜菌株L-D1的生長，故溶藻效果較弱。

參考文獻(xiàn)：

[1] 彭超，吳剛，席宇，等.3株溶藻細(xì)菌的分離鑒定及其溶藻效應(yīng)[J].環(huán)境科學(xué)研究；2003（01）：37-40+56

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ZHONG Hong

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gan, LI Pei, SUN Yang

(Sanya Marine and fishery monitoring center,sanya hainan 572000 China)

Abstract：A strain of marine algae-lysing bacteria designated as L-D1 was isolated from Dadonghai in Sanya of China.According to the studies the strain L-D1 could effectively dissolve Skeletonema costatum and lysed algae by drect and inderect ways.The inhibitory effect of chlorophyll a of Skeletonema costatum was better than other grades when temperature was 25 ℃.And the optimal salinity of algae-lysing is 20.In the dark condition，L-D1 was more inhibited on the chlorophylla content of algae.

Key words： Algae-lysing bacteria；Skeletonema costatum；Lysis；red tide

（收稿日期：2013-11-01；修回日期：2013-11-14）

圖4 6 d后，不同光照條件下溶藻細(xì)菌對中肋骨

條藻葉綠素a含量的影響

3.5.2 溫度對細(xì)菌溶藻效果的影響 不同溫度條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。25 ℃時中肋骨條藻葉綠素a的含量為0.049 mg/L，與30、35 ℃時相比葉綠素a的含量分別減少了75.62%、85.92%。如圖5所示，通過Duncan多重比較，表明溶藻細(xì)菌在25 ℃下對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖5 6 d后，不同溫度條件下溶藻細(xì)菌對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

3.5.3 鹽度對細(xì)菌溶藻效果的影響 不同鹽度條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。鹽度為20‰時中肋骨條藻葉綠素a的含量為0.119 mg/L，與鹽度為15‰、30‰、35‰時相比葉綠素a的含量分別減少了24.7%、30.41%、36.02%。如圖6所示，溶藻細(xì)菌在鹽度為20‰時對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖6 6 d后，不同鹽度條件下溶藻細(xì)菌對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

4 討論

作為防治赤潮的一種可能性生物，溶藻細(xì)菌的研究不但具有重要的理論價值還具有潛在的應(yīng)用價值。國內(nèi)外對于溶藻細(xì)菌的分離有多種途徑，裴海燕等[6] 利用海綿固定化微生物系統(tǒng)分離出了對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）、小球藻（Chlorella sp.）及柵藻（Scenedesmus sp.）具有較強(qiáng)溶解效果的細(xì)菌菌株。曹賓霞等[7]用試管法篩選對塔瑪亞歷山大藻具有溶藻能力的細(xì)菌。這兩種方法的工作量都較大。王海玉等[8]分離出一株紅色溶藻細(xì)菌對銅綠微囊藻有很強(qiáng)的溶解效果，該方法采用了果膠分解菌的培養(yǎng)基，所以對溶藻細(xì)菌的生存環(huán)境具有一定限制，在實(shí)際應(yīng)用中存在局限。本實(shí)驗(yàn)通過對固體平板溶藻法的改良，首先通過涂布法獲得不同細(xì)菌的單菌落，然后利用這些單菌落進(jìn)行固體培養(yǎng)基溶藻試驗(yàn)，選擇產(chǎn)生抑藻圈的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)基溶藻試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證其溶藻的效果。該方法分離周期短且操作簡單，是一種分離篩選溶藻細(xì)菌的有效途徑。

溶藻細(xì)菌主要通過以下方式實(shí)現(xiàn)溶藻效果：一是與藻細(xì)胞競爭營養(yǎng)物質(zhì)；二是分泌胞外物質(zhì)如蛋白質(zhì)、抗生素等作用于藻細(xì)胞，導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡；三是寄生于藻細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖，從而使得藻細(xì)胞裂解死亡[9]。在以往的研究中，大部分分離篩選得到的溶藻細(xì)菌屬于間接性溶藻，只有少部分屬于直接性溶藻[10]。為了探討菌株L-D1對中肋骨條藻的溶解方式，將不同方式處理的菌懸液按照一定比例加入到中肋骨條藻液體培養(yǎng)基中，均能抑制藻細(xì)胞的生長，其中菌原液對藻細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，經(jīng)濾膜過濾的菌液和經(jīng)離心沉降的菌液對藻細(xì)胞有一定的抑制作用，而經(jīng)高溫處理后的菌液仍有較強(qiáng)的溶藻活性，說明細(xì)菌分泌物具有很強(qiáng)的溶藻效果，且熱穩(wěn)定性較高。結(jié)果表明菌株L-D1的作用方式以間接溶藻為主，同時進(jìn)行直接溶藻。

光照主要通過光合作用影響藻細(xì)胞的生長，而對細(xì)菌的影響不大。很多研究表明在無光照的條件下，藻細(xì)胞的光合作用幾乎無法進(jìn)行，此時藻細(xì)胞很容易受到溶藻細(xì)菌的攻擊而死亡[11]。本研究得出的結(jié)論與其它研究一致，即全黑條件下菌株L-D1對中肋骨條藻生長的抑制效果最強(qiáng)。在光循環(huán)條件、全光條件下菌株L-D1的溶藻效果依次減弱。在全黑暗條件下，中肋骨條藻的光合作用無法進(jìn)行，而菌株L-D1的增殖卻不受影響。隨著培養(yǎng)時間的增加，溶藻細(xì)菌的數(shù)量逐漸超過藻細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)出較強(qiáng)的溶藻效果。而在全光照條件下，中肋骨條藻由于光適應(yīng)周期較長，所以藻細(xì)胞可以持續(xù)生長。其增長速度不斷提高，而細(xì)菌增長速度基本不變，所以藻細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)增長趨勢。

如果某一溫度有利于溶藻細(xì)菌的生長，而對藻細(xì)胞的生長影響很小或者具有一定抑制作用，那么將呈現(xiàn)出明顯的溶菌效果，反之，呈現(xiàn)出弱的溶藻效果或無溶藻效果[12]。由于中肋骨條藻為廣溫的典型代表，其在溫度較高時仍能保持很高的生長率。溫度在30～35 ℃時藻細(xì)胞的生長率超過菌株L-D1的，呈現(xiàn)出較弱的溶藻效果；而溫度在20～25 ℃時菌株L-D1的生長率超過藻細(xì)胞的，則呈現(xiàn)出較強(qiáng)的溶藻效果。

微藻和細(xì)菌都有最適生長鹽度，當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谠擕}度時，對其生長都會產(chǎn)生影響[13]。中肋骨條藻作為廣鹽的典型代表，鹽度的變化對其生長的影響并不明顯，而對菌株L-D1的影響則比較大。在鹽度為20‰～25‰時，其比較適宜菌株L-D1的生長，故溶藻效果比較明顯。而鹽度為15‰、35‰時，其不適宜菌株L-D1的生長，故溶藻效果較弱。

參考文獻(xiàn)：

[1] 彭超，吳剛，席宇，等.3株溶藻細(xì)菌的分離鑒定及其溶藻效應(yīng)[J].環(huán)境科學(xué)研究；2003（01）：37-40+56

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ZHONG Hong

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gan, LI Pei, SUN Yang

(Sanya Marine and fishery monitoring center,sanya hainan 572000 China)

Abstract：A strain of marine algae-lysing bacteria designated as L-D1 was isolated from Dadonghai in Sanya of China.According to the studies the strain L-D1 could effectively dissolve Skeletonema costatum and lysed algae by drect and inderect ways.The inhibitory effect of chlorophyll a of Skeletonema costatum was better than other grades when temperature was 25 ℃.And the optimal salinity of algae-lysing is 20.In the dark condition，L-D1 was more inhibited on the chlorophylla content of algae.

Key words： Algae-lysing bacteria；Skeletonema costatum；Lysis；red tide

（收稿日期：2013-11-01；修回日期：2013-11-14）

圖4 6 d后，不同光照條件下溶藻細(xì)菌對中肋骨

條藻葉綠素a含量的影響

3.5.2 溫度對細(xì)菌溶藻效果的影響 不同溫度條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。25 ℃時中肋骨條藻葉綠素a的含量為0.049 mg/L，與30、35 ℃時相比葉綠素a的含量分別減少了75.62%、85.92%。如圖5所示，通過Duncan多重比較，表明溶藻細(xì)菌在25 ℃下對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖5 6 d后，不同溫度條件下溶藻細(xì)菌對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

3.5.3 鹽度對細(xì)菌溶藻效果的影響 不同鹽度條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。鹽度為20‰時中肋骨條藻葉綠素a的含量為0.119 mg/L，與鹽度為15‰、30‰、35‰時相比葉綠素a的含量分別減少了24.7%、30.41%、36.02%。如圖6所示，溶藻細(xì)菌在鹽度為20‰時對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖6 6 d后，不同鹽度條件下溶藻細(xì)菌對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

4 討論

作為防治赤潮的一種可能性生物，溶藻細(xì)菌的研究不但具有重要的理論價值還具有潛在的應(yīng)用價值。國內(nèi)外對于溶藻細(xì)菌的分離有多種途徑，裴海燕等[6] 利用海綿固定化微生物系統(tǒng)分離出了對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）、小球藻（Chlorella sp.）及柵藻（Scenedesmus sp.）具有較強(qiáng)溶解效果的細(xì)菌菌株。曹賓霞等[7]用試管法篩選對塔瑪亞歷山大藻具有溶藻能力的細(xì)菌。這兩種方法的工作量都較大。王海玉等[8]分離出一株紅色溶藻細(xì)菌對銅綠微囊藻有很強(qiáng)的溶解效果，該方法采用了果膠分解菌的培養(yǎng)基，所以對溶藻細(xì)菌的生存環(huán)境具有一定限制，在實(shí)際應(yīng)用中存在局限。本實(shí)驗(yàn)通過對固體平板溶藻法的改良，首先通過涂布法獲得不同細(xì)菌的單菌落，然后利用這些單菌落進(jìn)行固體培養(yǎng)基溶藻試驗(yàn)，選擇產(chǎn)生抑藻圈的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)基溶藻試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證其溶藻的效果。該方法分離周期短且操作簡單，是一種分離篩選溶藻細(xì)菌的有效途徑。

溶藻細(xì)菌主要通過以下方式實(shí)現(xiàn)溶藻效果：一是與藻細(xì)胞競爭營養(yǎng)物質(zhì)；二是分泌胞外物質(zhì)如蛋白質(zhì)、抗生素等作用于藻細(xì)胞，導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡；三是寄生于藻細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖，從而使得藻細(xì)胞裂解死亡[9]。在以往的研究中，大部分分離篩選得到的溶藻細(xì)菌屬于間接性溶藻，只有少部分屬于直接性溶藻[10]。為了探討菌株L-D1對中肋骨條藻的溶解方式，將不同方式處理的菌懸液按照一定比例加入到中肋骨條藻液體培養(yǎng)基中，均能抑制藻細(xì)胞的生長，其中菌原液對藻細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，經(jīng)濾膜過濾的菌液和經(jīng)離心沉降的菌液對藻細(xì)胞有一定的抑制作用，而經(jīng)高溫處理后的菌液仍有較強(qiáng)的溶藻活性，說明細(xì)菌分泌物具有很強(qiáng)的溶藻效果，且熱穩(wěn)定性較高。結(jié)果表明菌株L-D1的作用方式以間接溶藻為主，同時進(jìn)行直接溶藻。

光照主要通過光合作用影響藻細(xì)胞的生長，而對細(xì)菌的影響不大。很多研究表明在無光照的條件下，藻細(xì)胞的光合作用幾乎無法進(jìn)行，此時藻細(xì)胞很容易受到溶藻細(xì)菌的攻擊而死亡[11]。本研究得出的結(jié)論與其它研究一致，即全黑條件下菌株L-D1對中肋骨條藻生長的抑制效果最強(qiáng)。在光循環(huán)條件、全光條件下菌株L-D1的溶藻效果依次減弱。在全黑暗條件下，中肋骨條藻的光合作用無法進(jìn)行，而菌株L-D1的增殖卻不受影響。隨著培養(yǎng)時間的增加，溶藻細(xì)菌的數(shù)量逐漸超過藻細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)出較強(qiáng)的溶藻效果。而在全光照條件下，中肋骨條藻由于光適應(yīng)周期較長，所以藻細(xì)胞可以持續(xù)生長。其增長速度不斷提高，而細(xì)菌增長速度基本不變，所以藻細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)增長趨勢。

如果某一溫度有利于溶藻細(xì)菌的生長，而對藻細(xì)胞的生長影響很小或者具有一定抑制作用，那么將呈現(xiàn)出明顯的溶菌效果，反之，呈現(xiàn)出弱的溶藻效果或無溶藻效果[12]。由于中肋骨條藻為廣溫的典型代表，其在溫度較高時仍能保持很高的生長率。溫度在30～35 ℃時藻細(xì)胞的生長率超過菌株L-D1的，呈現(xiàn)出較弱的溶藻效果；而溫度在20～25 ℃時菌株L-D1的生長率超過藻細(xì)胞的，則呈現(xiàn)出較強(qiáng)的溶藻效果。

微藻和細(xì)菌都有最適生長鹽度，當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谠擕}度時，對其生長都會產(chǎn)生影響[13]。中肋骨條藻作為廣鹽的典型代表，鹽度的變化對其生長的影響并不明顯，而對菌株L-D1的影響則比較大。在鹽度為20‰～25‰時，其比較適宜菌株L-D1的生長，故溶藻效果比較明顯。而鹽度為15‰、35‰時，其不適宜菌株L-D1的生長，故溶藻效果較弱。

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ZHONG Hong

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gan, LI Pei, SUN Yang

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Abstract：A strain of marine algae-lysing bacteria designated as L-D1 was isolated from Dadonghai in Sanya of China.According to the studies the strain L-D1 could effectively dissolve Skeletonema costatum and lysed algae by drect and inderect ways.The inhibitory effect of chlorophyll a of Skeletonema costatum was better than other grades when temperature was 25 ℃.And the optimal salinity of algae-lysing is 20.In the dark condition，L-D1 was more inhibited on the chlorophylla content of algae.

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（收稿日期：2013-11-01；修回日期：2013-11-14）