溶藻菌R1的溶藻特性

董小娜，陳澤慧，毛林強(qiáng)，王明新，張文藝

(常州大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 常州 213164)

每年夏秋季一些水體均發(fā)生有害藻華(HAB)暴發(fā)，給水環(huán)境生態(tài)帶來(lái)極大威脅，探索行之有效的溶藻方法迫在眉睫。利用溶藻菌(algicidalbacteria)溶藻安全高效，具有廣闊前景。近年來(lái),學(xué)者們?cè)谌茉寰暮Y選、溶藻活性代謝產(chǎn)物分析、溶藻微生物的溶藻機(jī)理等方面的研究相當(dāng)活躍，包括溶藻菌株的分離鑒定、溶藻性質(zhì)的描述、溶藻方式的探討、溶藻活性物質(zhì)的分離與純化[1-2]以及溶藻機(jī)理的研究等。尤其溶藻機(jī)理的研究更是深入到基因水平(分子水平)：藻細(xì)胞的細(xì)胞水平[3-4]、功能酶和蛋白水平[5-6]等。近年來(lái)溶藻菌的篩選成果頗多[7]，已分離鑒定出來(lái)的菌屬有粘細(xì)菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等[8]，因藻類(lèi)的暴發(fā)與溶藻菌的生長(zhǎng)息息相關(guān)，這些溶藻菌多來(lái)自藻華頻繁暴發(fā)地帶。細(xì)菌溶藻方式主要有2種：直接溶藻與間接溶藻，見(jiàn)諸報(bào)道的溶藻菌多具有間接溶藻特性[9]。對(duì)溶藻能力的測(cè)定方法有：藻細(xì)胞數(shù)量的變化、chl-a含量的變化及其采用藻膽蛋白(某些藻類(lèi)如藍(lán)藻)的含量變化等。對(duì)溶藻機(jī)理的研究越來(lái)越多，眾多分析方法被用于揭示溶藻產(chǎn)物溶藻機(jī)理，如：傅里葉紅外光譜、熒光光譜、透射電鏡等[10]。細(xì)菌分泌的物質(zhì)(如氨基酸、抗生素、多肽等)[11]成分復(fù)雜，不同的溶藻菌分泌有效溶藻成分也不盡相同，這讓溶藻活性物質(zhì)的分離純化非常困難，目前分離純化出有效溶藻物質(zhì)罕見(jiàn)報(bào)道。報(bào)道的溶藻活性物質(zhì)的分離純化主要有2種方法：硅膠柱層析[12]與高效液相色譜(HPLC)方法[13]。對(duì)活性物質(zhì)的鑒定方法有液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)[13]、液相二級(jí)質(zhì)譜(LC-MS-MS)等。但這還僅僅只是限于實(shí)驗(yàn)室研究階段，在實(shí)踐中直接利用的效果并不理想，其活性物質(zhì)的分離純化困難且收集率低，這使得生物菌劑投產(chǎn)與使用都難以實(shí)現(xiàn)。

采用三維熒光技術(shù)對(duì)藻膽蛋白的測(cè)定來(lái)表征溶藻效果，借助三維熒光光譜解析溶藻降解產(chǎn)物；通過(guò)對(duì)菌液進(jìn)行熱處置、破碎處置、酸堿處置、透析處置等手段研究了菌株R1 Lysinibacillus macroides的溶藻機(jī)理；并通過(guò)HPLC技術(shù)初步分離提取了有效溶藻物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 藻種來(lái)源：銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所。

菌種來(lái)源：從太湖激浪魚(yú)內(nèi)臟(魚(yú)鰓、魚(yú)腸等)中篩選出了1株溶藻效果較佳的菌株R1，培養(yǎng)2 d后，菌落呈圓形，直徑大約1～2 mm，白色，表面光滑，微微凸起，邊緣光滑，生長(zhǎng)快速；革蘭氏染色呈紫色,為陽(yáng)性菌(如圖1)，經(jīng)生理生化及16S rDNA序列分析，其與Lysinibacillusmacroides相似性最高，達(dá)99.50%。

圖1 R1革蘭氏染色

1.1.2 主要儀器和試劑 1)試劑：試劑均為中國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2)儀器：離心機(jī)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、高壓蒸汽滅菌鍋、倒置顯微鏡、島津紫外分光光度計(jì)UV-1800、Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)等。

1.1.3 培養(yǎng)基及其他試劑 LB培養(yǎng)基[14]、銅綠微囊藻培養(yǎng)基BG-11[15]

1.2 方法

1.2.1 菌株溶藻能力考察 為探索菌株R1的溶藻效果，取10 mL培養(yǎng)24 h的R1菌液接種到100 mL銅綠微囊藻溶液中(初始chl-a含量為205.11 mg/L)，27 ℃、光暗比12 h∶12 h周期下培養(yǎng)，每天定期手動(dòng)搖晃2～3次，每隔2 d測(cè)得chl-a含量變化，通過(guò)式(1)[16]計(jì)算溶藻率并繪制曲線，同時(shí)做空白對(duì)照。

η=(Cc-Ct)/Cc×100%

(1)

式中：η為溶藻率,%；Cc為初始chl-a含量,mg/L；Ct為后期chl-a含量,mg/L。

1.2.2 三維熒光考察溶藻效果 通過(guò)測(cè)定chl-a含量的方法考察溶藻效果較為繁瑣，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，且需要耗費(fèi)許多提取物；使用顯微鏡觀察藻細(xì)胞形態(tài)數(shù)量是最傳統(tǒng)的浮游藻類(lèi)分析方法，該方法工作量大，比較繁瑣，且有時(shí)辨別不清[17]。銅綠微囊藻有很強(qiáng)的熒光特性的藻膽蛋白，是一種卟啉類(lèi)色素蛋白，卟啉具有π電子結(jié)構(gòu)[9]，在特定的波長(zhǎng)照射下有很強(qiáng)的熒光反應(yīng)。熒光光譜分析方法快速、準(zhǔn)確、樣品不需要特別處置、簡(jiǎn)單高效。銅綠微囊藻細(xì)胞具有如下熒光特性：藻密度與發(fā)射波長(zhǎng)無(wú)關(guān)[18]，在低濃度下，熒光強(qiáng)度與溶液濃度成正比，可進(jìn)行定量分析[18-20]。

為表征菌株溶藻過(guò)程，對(duì)菌藻混合液(參照1.2.1)進(jìn)行了三維熒光譜圖分析，取菌藻混合液，進(jìn)行三維熒光掃描，發(fā)射波長(zhǎng)(簡(jiǎn)稱Em)280～900 nm/280～550 nm，激發(fā)波長(zhǎng)(簡(jiǎn)稱Ex)220～800 nm/220～400 nm；狹縫寬度為5 nm；

每隔一段時(shí)間收集混合液測(cè)Em為650 nm的三維熒光光譜，通過(guò)式(2)[21]計(jì)算溶藻率并繪制曲線。

η=(Fc-Ft)/Fc×100%

(2)

式中：η為溶藻率，%；Fc為藻膽蛋白初始光強(qiáng)，A.U；Ft為后期藻膽蛋白的光強(qiáng)，A.U。

1.2.3 三維熒光圖譜EMMs結(jié)合平行因子分析考察溶藻產(chǎn)物 為表征菌株溶藻產(chǎn)物，對(duì)降解后的藻液進(jìn)行了三維熒光譜圖分析，發(fā)射波長(zhǎng)(簡(jiǎn)稱Em)280～550 nm，狹縫寬度為2 nm；激發(fā)波長(zhǎng)(簡(jiǎn)稱Ex)220～400 nm；狹縫寬度為5 nm；同時(shí)，考察純?cè)逡杭捌渚旱臒晒馓匦?。EEMs分析物質(zhì)鑒定，主要采用目視鑒定，無(wú)法避免光譜重疊帶來(lái)的誤差且具有主觀性。采用三維熒光圖譜結(jié)合平行因子分析考察溶藻產(chǎn)物：1)數(shù)據(jù)預(yù)處理：并用Delauay三角形內(nèi)插值法瑞利散射及拉曼散射。2)平行因子分析：平行因子算法是基于三線性分解理論，采用交替最小二乘原理，進(jìn)行迭代的三維數(shù)陣分解算法?？梢詫⒁粋€(gè)由多個(gè)三維熒光光譜矩陣分解為3個(gè)方向的載荷矩陣。通過(guò)對(duì)半檢驗(yàn)法(split-half analysis)，殘差平方和的最小，及核一致性檢驗(yàn)來(lái)確定模型的有效性。采用MATLAB軟件中的Nway toolbox運(yùn)行[22-24]。

1.2.4 菌株的溶藻特性 為探討溶藻細(xì)菌的溶藻機(jī)制，將培養(yǎng)24 h溶藻細(xì)菌R1培養(yǎng)液進(jìn)行如下處理:

1)離心過(guò)濾上清液(8 000 r/min，10 min；過(guò)0.22 μm濾膜)、高熱處理上清液(121 ℃，20 min)、菌體破碎液(取離心后的菌體沉淀超聲波破碎)[16]。

2)酸堿化處置[12]：為考察pH對(duì)溶藻物質(zhì)活性的影響，分別調(diào)節(jié)菌液pH為4、7、10，處置1 h后調(diào)回中性，同時(shí)做不加菌的空白對(duì)照，接菌量為10%(體積)，采用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板(biologix 24孔板)進(jìn)行溶藻實(shí)驗(yàn)，并采用顯微鏡計(jì)數(shù)法檢查溶藻效果。

3)截留分子量[12]：為考察溶藻活性物質(zhì)的分子大小，分別采用截留分子量為100、500、1 000 da的透析袋對(duì)培養(yǎng)24 h后的菌液進(jìn)行透析1 d，取透析袋中截留液于裝載銅綠微囊藻溶液的24孔板中，檢查溶藻效果。

1.2.5 溶藻活性物質(zhì)的純化與分離[13]

1)菌液前處理：接種菌株R1至500 mL的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、135 r/min，培養(yǎng)24 h；采用0.45 um的濾膜過(guò)濾；收集菌液并加入4倍體積的乙醇進(jìn)行萃取，磁力攪拌30 min，后靜置2 h；使用0.22 um的濾膜過(guò)濾；收集菌液60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；無(wú)菌水重溶，4 ℃保存。

2)HPLC：通過(guò)液相色譜初步確定可能性溶藻物質(zhì)。色譜條件為：色譜柱wonda sil C18(4.6×250 mm)，流動(dòng)相A(甲醇)∶B(1%乙酸)為1∶9，檢測(cè)波長(zhǎng)為UV200 nm。

3)為考察這幾個(gè)物質(zhì)是否含有溶藻活性物質(zhì)，每隔一段時(shí)間收集1餾分，氮?dú)獯蹈?，超純水重溶，并采?4孔板進(jìn)行溶藻效果檢驗(yàn)。對(duì)有溶藻活性的收集液，再次使用HPLC檢查其純度及其峰值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株R1的溶藻能力

將R1菌液到銅綠微囊藻溶液中(初始chl-a為205.11 mg/L)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)肉眼觀察顏色變化及chl-a含量測(cè)定檢驗(yàn)溶藻效果，如圖2。實(shí)驗(yàn)4 d后，肉眼可見(jiàn)混合液發(fā)生黃化現(xiàn)象，chl-a含量不斷減少，10 d后剩余chl-a含量?jī)H為35.61 mg/L，降解率達(dá)82.64%；同時(shí)觀察到空白樣顏色更加深綠，經(jīng)測(cè)定chl-a含量，從初始205.11 mg/L增長(zhǎng)到324.56 mg/L。

圖2 溶藻細(xì)菌R1對(duì)chl-a含量的影響Fig.2 Effects of R1 on chlorophyll

2.2 三維熒光分析R1溶藻能力

取0、3、7、10、12 d的菌藻混合液進(jìn)行三維熒光光譜掃描并分析，如圖3。溶藻過(guò)程中藻膽蛋白熒光峰Em/Ex為650 nm/630 nm，熒光光強(qiáng)不斷減少。為表征其溶藻效果，通過(guò)固定Em為650 nm，將得到的熒光光譜減去去離子水的熒光光譜以去除瑞利散射的影響，將瑞利散射峰置零[18]，采用oringin8.6擬合得到光強(qiáng)與激發(fā)波長(zhǎng)的關(guān)系圖，如圖4。按照式2)計(jì)算，10 d溶藻率為達(dá)89.80%，與通過(guò)chl-a表征的溶藻率82.64%相近，可作為溶藻細(xì)菌溶藻效率的一種評(píng)價(jià)方法。

圖3 菌藻液的三維熒光圖Fig.3 Three-dimensional fluorescence of

圖4 Em 650 nm的激發(fā)光譜及溶藻效果圖Fig.4 The excitation spectra at the transmitting wavelength of 650 nm and Dissolving rate of

2.3 菌株R1溶藻機(jī)制研究

1)由表1及圖5(1)看出：R1菌原液、離心上清液、高溫滅菌液都發(fā)生了明顯的黃化現(xiàn)象，溶藻效果顯著；菌體破碎液及菌體沒(méi)有溶藻效果；可見(jiàn)，其溶藻物質(zhì)并不是胞內(nèi)物質(zhì)，也不是菌株本身，而是細(xì)菌分泌的胞外物質(zhì)，具有耐高溫的特性，推測(cè)為非蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)。

2)由表2及圖5(2)看出，經(jīng)過(guò)不同處置的R1菌液都具有很強(qiáng)的溶藻效果，與空白對(duì)比，藻液均發(fā)生明顯的黃化現(xiàn)象；顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2，從表中可見(jiàn)，藻細(xì)胞數(shù)量都明顯減少，由此可見(jiàn)，溶藻活性物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，具有耐酸耐堿性。

3)經(jīng)100、500、1 000 da的透析袋截留分子量后袋中截留液，顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3，發(fā)現(xiàn)溶藻能力強(qiáng)弱順序依次為100 da>500 da>1 000 da，其中，1 000 da溶藻活性很低，由此可見(jiàn)，細(xì)菌分泌的有效溶藻物質(zhì)為小分子物質(zhì)，分子量小于500 da。

表1 不同菌體處理方式對(duì)溶藻效果的影響Table 1 Effect of different gloop treatment methods on algae-lysing efficiency (cell·mL-1)

表2 不同pH處置方式對(duì)溶藻效果的影響Table 2 Effect of different pH disposal methods on algae-lysing efficiency (cell·mL-1)

表3 不同截留分子量對(duì)溶藻效果影響Table 3 Effect of different molecular weight on algae-lysing efficiency (cell·mL-1)

圖5 R1菌液經(jīng)不同處理對(duì)溶藻的效果影響Fig.5 The algae-lysing efficiency of R1 bacteria solution

2.4 三維熒光圖譜結(jié)合平行因子模型分析R1溶藻產(chǎn)物

菌株R1溶藻過(guò)程中,Em/Ex為400～600 nm/250～450 nm處出現(xiàn)了大面積的熒光反應(yīng)，熒光光譜不成規(guī)則的圓形，成分復(fù)雜，如圖3。分別對(duì)銅綠微囊藻分泌物、菌液及其降解后的菌藻共培液液進(jìn)行三維熒光光譜掃描，三維矩陣圖譜見(jiàn)圖6，分別為藻細(xì)胞產(chǎn)生的溶解性代謝性產(chǎn)物(EOM)(Em/Ex 335 nm/280 nm)、R1菌液的主要溶解性熒光組分(Em/Ex 335 nm/280 nm、Em/Ex 435～475 nm/350～380 nm、Em/Ex 475 nm/280 nm)及溶藻產(chǎn)物組分(Em/Ex 335 nm/280 nm、 Em/Ex 335 nm/230 nm)。

圖6 菌藻混合液的三維熒光光譜EMMsFig.6 Three-dimensional fluorescence spectra of algal

運(yùn)用PARAFAC模型結(jié)合EMMs圖譜對(duì)溶藻產(chǎn)物的三維熒光矩陣進(jìn)行解析，并通過(guò)殘差和最小分析法及裂半分析法，識(shí)別出溶藻混合液共含有可分為2個(gè)類(lèi)型。分別為：475 nm/250～350 nm；330 nm/220～270 nm，對(duì)應(yīng)及類(lèi)色氨酸類(lèi)物質(zhì)[22-24]。這2個(gè)成分的熒光圖譜及激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)載荷見(jiàn)圖7。從圖中可見(jiàn)，2個(gè)熒光成分的激發(fā)載荷圖譜具有2個(gè)激發(fā)峰和1個(gè)發(fā)射峰，主要體現(xiàn)了長(zhǎng)波類(lèi)腐殖質(zhì)及色氨酸物，分析其溶藻過(guò)程中，長(zhǎng)波類(lèi)類(lèi)色氨酸類(lèi)物質(zhì)增加，為主要溶藻產(chǎn)物。根據(jù)其成分可推測(cè)出，藻細(xì)胞死亡后，胞內(nèi)的物質(zhì)及細(xì)胞組分大量釋放到混合液中。長(zhǎng)波類(lèi)類(lèi)腐殖酸減少，根據(jù)其化學(xué)形成原理(由-COOH、-OH基團(tuán)的有機(jī)化合物合成的結(jié)果)，其中可能含有迫使藻死亡的有效成分，結(jié)合其分子量及極性特征猜測(cè)可能為小分子的疏水性氨基酸(hydrophbic acid)。

圖7 PARAPC分析溶藻組分及其激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)載荷Fig.7 Fluorescence components identified by the PARAFAC model and their excitation and emission wavelengths

2.5 溶藻活性物質(zhì)的分離與純化

圖8 粗提液的HPLC-200 nm掃描圖Fig.8 HPLC-200 nm scan of crude

溶藻活性物質(zhì)的分離難度大，目前溶藻物質(zhì)的分離純化的報(bào)道目前還很少。本研究通過(guò)采用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)分離提純粗提液，掃描波長(zhǎng)200 nm的色譜圖，見(jiàn)圖8。圖中具有多個(gè)物質(zhì)峰，可見(jiàn)經(jīng)前處理的菌液成分仍很復(fù)雜。每分鐘收集1餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，超純水重溶，并采用24孔板進(jìn)行溶藻效果檢驗(yàn)。其中有1餾分具有溶藻效果，見(jiàn)如9，其在既定條件下有個(gè)主要峰，保留時(shí)間分別為6.005。結(jié)合熒光光譜分析，結(jié)合熒光光譜分析，其屬于某種疏水性酸類(lèi)。由于HPLC分離效率低，分離量極少而且成本很高，分離的餾分中仍還有其他成分，其溶藻物質(zhì)仍需進(jìn)一步分離及鑒定。

圖9 溶藻活性物的HPLC-200 nm掃描圖Fig.9 The HPLC-200 nm scan of the lytic active

3 結(jié)論

1)從太湖土著激蕩魚(yú)內(nèi)臟中篩選的R1菌(Lysinibacillusmacroides)，以銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)為受試對(duì)象，10 d內(nèi)chl-a含量從205.11 mg/L降至35.61 mg/L，溶藻率達(dá)82.64%。高溫處置、酸堿處置、透析處置手段確定R1菌通過(guò)分泌耐高溫的非蛋白類(lèi)物質(zhì)溶藻，屬于間接溶藻，且該物質(zhì)具有耐酸耐堿性，其分子量小于500 da。

2)熒光光譜能夠很好的表征銅綠微囊藻含量的變化，其熒光物質(zhì)為藻膽蛋白。溶藻過(guò)程中其強(qiáng)度不斷減少，可見(jiàn)藻細(xì)胞不斷被破壞，數(shù)量被不斷減少。固定Em為650 nm，通過(guò)熒光激發(fā)光譜圖對(duì)藻細(xì)胞密度進(jìn)行定量分析。通過(guò)熒光光強(qiáng)表征溶藻效果，避免了傳統(tǒng)藻類(lèi)測(cè)量過(guò)程的繁瑣，具有重要意義。熒光光譜分析表明溶藻活性物質(zhì)可能為疏水性酸。溶藻過(guò)程中，長(zhǎng)波類(lèi)類(lèi)色氨酸類(lèi)物質(zhì)增加，為主要溶藻產(chǎn)物。根據(jù)其成分可推測(cè)出，藻細(xì)胞死亡后，胞內(nèi)的物質(zhì)及細(xì)胞組分大量釋放到混合液中。長(zhǎng)波類(lèi)類(lèi)腐殖酸減少，根據(jù)其成分(含有-COOH、-OH基團(tuán)的有機(jī)化合物)猜測(cè)，其中可能含有迫使藻死亡的有效成分，可能為某種疏水性氨基酸(hydrophbic acid)。

3)采用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)分離提純粗提液(掃描波長(zhǎng)200 nm)，分離結(jié)果表明，從R1粗提液中分離出的1餾分溶藻活性物質(zhì)，其在既定條件下其出峰時(shí)間為6～8 min左右，推測(cè)其為某種酸類(lèi)物質(zhì)，但這需要進(jìn)一步的分離和鑒定。