冰凍對(duì)硝化細(xì)菌制劑活性的影響

任杰+周洋+孔小蓉+宋志文

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.05.003

摘 要：在實(shí)驗(yàn)室模擬條件下，研究冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌和海水型硝化細(xì)菌制劑中氨氧化細(xì)菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌活性的影響。結(jié)果表明，冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌和海水型硝化細(xì)菌制劑活性均有較為明顯的抑制作用，且10 d處理組的抑制作用高于5 d處理組，對(duì)淡水型硝化細(xì)菌制劑活性的抑制作用大于海水型硝化細(xì)菌制劑。液體硝化細(xì)菌制劑在冬季運(yùn)輸和保存過(guò)程中要采取保溫措施，以避免由于冰凍導(dǎo)致的菌劑活性降低。

關(guān)鍵詞：硝化細(xì)菌制劑；冰凍；活性；降解速率

硝化細(xì)菌是一類(lèi)廣泛存在于自然界在氮循環(huán)中起到重要作用的微生物，包括氨氧化細(xì)菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌兩類(lèi)。前者將氨氧化成亞硝酸鹽，后者進(jìn)一步將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽。由于通過(guò)硝化作用過(guò)程可將毒性較強(qiáng)的氨和亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為相對(duì)低毒的硝酸鹽，因此硝化細(xì)菌菌劑在污水處理、水產(chǎn)養(yǎng)殖和水族觀賞等領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛[1-2]。

近年來(lái)，硝化細(xì)菌已逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖和水族領(lǐng)域的熱門(mén)話題，它在水產(chǎn)養(yǎng)殖和水族中的重要性開(kāi)始引起廣泛的注意。可以說(shuō)，迄今為止，在大規(guī)模、集約化的水產(chǎn)養(yǎng)殖模式中，如果沒(méi)有硝化細(xì)菌參與其中的凈水作用，想獲得成功養(yǎng)殖是難以實(shí)現(xiàn)的。目前市場(chǎng)上出售的硝化細(xì)菌制劑很多，其中相當(dāng)一部分是液體制劑，在北方冬季運(yùn)輸和儲(chǔ)存中存在冰凍現(xiàn)象，由于硝化細(xì)菌對(duì)溫度、pH等諸多環(huán)境因子敏感[3-5]，因此冰凍是否會(huì)影響其活性，一直是硝化細(xì)菌生產(chǎn)者和消費(fèi)者較為關(guān)心的問(wèn)題。

本課題組前期在硝化細(xì)菌菌劑制備及應(yīng)用方面做了大量工作，在水族和水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域均取得較好的效果[6-9]。本研究以自行培養(yǎng)的淡水型和海水型硝化細(xì)菌制劑為研究對(duì)象，在通過(guò)實(shí)驗(yàn)?zāi)M確定冰凍對(duì)硝化細(xì)菌制劑中氨氧化細(xì)菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌活性的影響，從而為硝化細(xì)菌制劑的推廣與應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

722型分光光度計(jì)、HZS-H水浴振蕩器、pHS-3C型精密酸度計(jì)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 菌劑 淡水型和海水型硝化細(xì)菌，由本實(shí)驗(yàn)室自行培養(yǎng)，為氨氧化細(xì)菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌的混合培養(yǎng)物。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 無(wú)氨蒸餾水、碘化鉀、碘化汞、酒石酸鉀鈉、氯化銨。

1.2.3 人工海水 由海水素（青島通用海大海水素有限公司）人工配制而成。

1.3 研究方法

將淡水型硝化細(xì)菌和海水型硝化細(xì)菌制劑分別分成3組，I組在-20 ℃冰箱冷凍保存5 d，II組-20 ℃冰箱冷凍保存10 d，III組為常溫條件下保存的對(duì)照組。

1.3.1 冰凍對(duì)氨氧化細(xì)菌活性的影響 用氯化銨配制氨氮含量為50 mg/L的溶液（海水型硝化細(xì)菌用人工海水配制），加至250 mL錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶加入100 mL，分別加入常溫保存硝化細(xì)菌制劑、冰凍5 d的硝化細(xì)菌制劑、冰凍10 d的硝化細(xì)菌制劑各5 mL。將錐形瓶置于水浴振蕩器中，25 ℃水浴溫度下，130 r/min搖瓶培養(yǎng)。每隔12 h測(cè)定樣品中氨氮含量。每組兩個(gè)重復(fù)。

1.3.2 冰凍對(duì)亞硝酸鹽氧化細(xì)菌活性的影響 用亞硝酸鈉配制含量為20 mg/L的溶液（海水型硝化細(xì)菌用人工海水配制），加至250 mL錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶加入100 mL，分別加入常溫保存硝化細(xì)菌制劑、冰凍5 d的硝化細(xì)菌制劑、冰凍10 d的硝化細(xì)菌制劑各5 mL。將錐形瓶置于水浴振蕩器中，25 ℃水浴溫度下，130 r/min搖瓶培養(yǎng)。每隔1 d測(cè)定樣品中亞硝酸鹽含量。每組兩個(gè)重復(fù)。

1.4 分析方法

水中氨氮采用納氏試劑分光光度法測(cè)定；亞硝酸鹽氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法測(cè)定[10-11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 冰凍對(duì)氨氧化細(xì)菌活性的影響

冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌中氨氧化細(xì)菌活性的影響見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出，冰凍對(duì)氨氧化細(xì)菌活性有一定程度影響，對(duì)照組中氨氮下降速率明顯快于實(shí)驗(yàn)組，50 mg/L氨氮經(jīng)84 h即降至檢測(cè)不出。而冰凍5 d的實(shí)驗(yàn)組和冰凍10 d的實(shí)驗(yàn)組經(jīng)144 h處理后氨氮含量還分別為23.3 mg/L和34.6 mg/L。

經(jīng)計(jì)算，對(duì)照組氨氮降解速率為1 628 mg NH3-N/gMlvss?d，冰凍5 d組的氨氮降解速率為507 mg NH3-N/gMlvss?d，冰凍10 d組氨氮降解速率為292 mg NH3-N/gMlvss?d，冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌制劑中氨氧化細(xì)菌的活性有較為明顯的抑制作用。

圖1 冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌制劑

中氨氧化細(xì)菌活性的影響

冰凍對(duì)海水型硝化細(xì)菌中氨氧化細(xì)菌活性的影響見(jiàn)圖2，從圖2中可以看出，冰凍對(duì)氨氧化細(xì)菌活性有一定程度影響，對(duì)照組中氨氮下降速率明顯快于實(shí)驗(yàn)組，50 mg/L氨氮經(jīng)84 h即降至檢測(cè)不出。而冰凍5 d的實(shí)驗(yàn)組和冰凍10 d的實(shí)驗(yàn)組經(jīng)144 h處理后氨氮含量還分別為22.4 mg/L和25.4 mg/L。

經(jīng)計(jì)算，對(duì)照組的氨氮降解速率為2 455 mg NH3-N/gMlvss?d，冰凍5 d組氨氮降解速率為790 mg NH3-N/gMlvss?d，冰凍10 d組氨氮降解速率為704 mg NH3-N/gMlvss?d，冰凍對(duì)海水型硝化細(xì)菌制劑中氨氧化細(xì)菌的活性有較為明顯的抑制作用。

圖2 冰凍對(duì)海水型硝化細(xì)菌制劑中

氨氧化細(xì)菌活性的影響

2.2 冰凍對(duì)亞硝酸鹽氧化細(xì)菌活性的影響

冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌中亞硝酸鹽氧化細(xì)菌活性的影響見(jiàn)圖3，從圖3中可以看出，對(duì)照組亞硝酸鹽氮下降明顯快于實(shí)驗(yàn)組，20 mg/L亞硝酸鹽經(jīng)4 d即可降至檢測(cè)不出。而冰凍5 d的實(shí)驗(yàn)組經(jīng)7 d處理后，亞硝酸鹽氮降至1.2 mg/L；冰凍10 d的實(shí)驗(yàn)組經(jīng)7 d處理后亞硝酸鹽氮仍為15.0 mg/L。

圖3 冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌制劑中

氨氧化細(xì)菌活性的影響

經(jīng)計(jì)算，對(duì)照組亞硝酸鹽氮降解速率為360 mg NO2--N/gMlvss?d，冰凍5 d組亞硝酸鹽氮降解速率為193 mg NH3-N/gMlvss?d，冰凍10 d組氨氮降解速率為51 mg NO2--N/gMlvss?d，冰凍對(duì)淡水硝化細(xì)菌制劑中亞硝酸鹽氧化細(xì)菌的活性有較為明顯的抑制作用。

冰凍對(duì)海水型硝化細(xì)菌中亞硝酸鹽氧化細(xì)菌活性的影響見(jiàn)圖4，從圖中可以看出，對(duì)照組亞硝酸鹽氮下降明顯快于實(shí)驗(yàn)組，20 mg/L亞硝酸鹽經(jīng)7 d即可降至0.7 mg/L。而冰凍5 d的實(shí)驗(yàn)組經(jīng)7 d處理后，亞硝酸鹽氮降至4.7 mg/L；冰凍10 d的實(shí)驗(yàn)組經(jīng)7 d處理后亞硝酸鹽氮仍為7.7 mg/L。

經(jīng)計(jì)算，對(duì)照組亞硝酸鹽氮降解速率為461 mg NO2--N/gMlvss?d，冰凍5 d組亞硝酸鹽氮降解速率為353 mg NH3-N/gMlvss?d，冰凍10 d組亞硝酸鹽氮降解速率為283 mg NO2--N/gMlvss?d，冰凍對(duì)海水型硝化細(xì)菌制劑中亞硝酸鹽氧化細(xì)菌的活性有較為明顯的抑制作用。

圖4 冰凍對(duì)海水型硝化細(xì)菌制劑

亞硝酸鹽氧化細(xì)菌活性的影響

冰凍對(duì)于硝化細(xì)菌具有明顯的抑制作用，且抑制作用隨時(shí)間增長(zhǎng)而加強(qiáng)，主要是由于低溫形成的冰晶對(duì)細(xì)菌細(xì)胞具有傷害作用，細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰則對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞器乃至整個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌的影響要大于海水型硝化細(xì)菌，分析原因可能是海水型硝化細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)是在人工海水條件下進(jìn)行的，較高的離子強(qiáng)度對(duì)硝化細(xì)菌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。3 結(jié)論

冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌和海水型硝化細(xì)菌制劑活性均有較為明顯的抑制作用，且10 d處理組的抑制作用高于5 d處理組。

冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌制劑活性的抑制作用大于海水型硝化細(xì)菌制劑。

液體硝化細(xì)菌制劑在冬季運(yùn)輸和保存過(guò)程中要采取保溫措施，以避免由于冰凍導(dǎo)致的菌劑活性降低。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉志培,劉雙江.硝化作用微生物的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2004（04）:521-525

[2] 朱曉東,張根玉,朱雅珠,等.硝化細(xì)菌的生物學(xué)特性以及在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)科技情報(bào),2009,36(5):221-224

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[4] 王歆鵬,陳堅(jiān),華兆哲,等.硝化菌群在不同條件下的增殖速率和硝化活性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),1999,5(1): 64-68

[5] Sudarno U,Winter J,Gallert C.Effect of varying salinity,temperature,ammonia and nitrous acid concentrations on nitrification of saline wastewater in fixed-bed reactors[J].Bioresour.Technol.,2011,102(10):5665-5673

[6] 劉冉,周洋,宋志文,等.硝化細(xì)菌對(duì)海參養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)的凈化效果[J].河北漁業(yè),2012（2）:15-18

[7] 宋志文,徐敏,溫少鵬,等.硝化細(xì)菌制劑對(duì)淡水水族箱水質(zhì)的凈化效果[J].河北漁業(yè),2007（7）:29-31

[8] 周洋,孔小蓉,宋志文,等.硝化細(xì)菌對(duì)海水水族箱硝化功能建立過(guò)程的影響[J].河北漁業(yè),2009（3）:4-6

[9] 吳偉,宋志文,于弘路,等.氨負(fù)荷對(duì)水族箱硝化功能建立過(guò)程的影響[J].河北漁業(yè),2010（11）:4-7

[10] 中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)部.水質(zhì)氨氮的測(cè)定納氏試劑分光光度法( HJ535-2009).北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,2009

[11] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法(第四版)[M].北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,2002

Effects of frost on the activity of nitrifying bacteria preparation

REN Jie1,ZHOU Yang2,KONG Xiao

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rong1,SONG Zhi

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wen1

(1. Qingdao Technological University, Qingdao 266033, China; 2.Management Office of Jihongtan Reservoir, the project of

water diversion from the Yellow River into Qingdao in Shandong, Qingdao 266111, China )

Abstract：Simulated conditions in the laboratory to study frost effects on activity of ammonia-oxidizing bacteria and nitrite-oxidizing bacteria in freshwater and marine nitrifying bacteria preparation.The results showed that frost had obvious inhibitory effect on activity of freshwater and marine nitrifying bacteria preparation.And the inhibitory effect on frost for ten days was greater than on frost for five days,the inhibitory effect on activity of nitrifying bacteria preparation was greater than on marine nitrifying bacteria preparation.In order to avoid the decrease of bacteria preparation activity because of frost,insulation measures should be taken to liquid nitrifying bacteria preparation during the transport and storage in winter.

Key words：nitrifying bacteria preparation; frost; activity; degradation rate

（收稿日期：2014-01-27）

圖4 冰凍對(duì)海水型硝化細(xì)菌制劑

亞硝酸鹽氧化細(xì)菌活性的影響

冰凍對(duì)于硝化細(xì)菌具有明顯的抑制作用，且抑制作用隨時(shí)間增長(zhǎng)而加強(qiáng)，主要是由于低溫形成的冰晶對(duì)細(xì)菌細(xì)胞具有傷害作用，細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰則對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞器乃至整個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌的影響要大于海水型硝化細(xì)菌，分析原因可能是海水型硝化細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)是在人工海水條件下進(jìn)行的，較高的離子強(qiáng)度對(duì)硝化細(xì)菌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。3 結(jié)論

冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌和海水型硝化細(xì)菌制劑活性均有較為明顯的抑制作用，且10 d處理組的抑制作用高于5 d處理組。

冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌制劑活性的抑制作用大于海水型硝化細(xì)菌制劑。

液體硝化細(xì)菌制劑在冬季運(yùn)輸和保存過(guò)程中要采取保溫措施，以避免由于冰凍導(dǎo)致的菌劑活性降低。

參考文獻(xiàn)：

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[4] 王歆鵬,陳堅(jiān),華兆哲,等.硝化菌群在不同條件下的增殖速率和硝化活性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),1999,5(1): 64-68

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[6] 劉冉,周洋,宋志文,等.硝化細(xì)菌對(duì)海參養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)的凈化效果[J].河北漁業(yè),2012（2）:15-18

[7] 宋志文,徐敏,溫少鵬,等.硝化細(xì)菌制劑對(duì)淡水水族箱水質(zhì)的凈化效果[J].河北漁業(yè),2007（7）:29-31

[8] 周洋,孔小蓉,宋志文,等.硝化細(xì)菌對(duì)海水水族箱硝化功能建立過(guò)程的影響[J].河北漁業(yè),2009（3）:4-6

[9] 吳偉,宋志文,于弘路,等.氨負(fù)荷對(duì)水族箱硝化功能建立過(guò)程的影響[J].河北漁業(yè),2010（11）:4-7

[10] 中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)部.水質(zhì)氨氮的測(cè)定納氏試劑分光光度法( HJ535-2009).北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,2009

[11] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法(第四版)[M].北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,2002

Effects of frost on the activity of nitrifying bacteria preparation

REN Jie1,ZHOU Yang2,KONG Xiao

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rong1,SONG Zhi

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wen1

(1. Qingdao Technological University, Qingdao 266033, China; 2.Management Office of Jihongtan Reservoir, the project of

water diversion from the Yellow River into Qingdao in Shandong, Qingdao 266111, China )

Abstract：Simulated conditions in the laboratory to study frost effects on activity of ammonia-oxidizing bacteria and nitrite-oxidizing bacteria in freshwater and marine nitrifying bacteria preparation.The results showed that frost had obvious inhibitory effect on activity of freshwater and marine nitrifying bacteria preparation.And the inhibitory effect on frost for ten days was greater than on frost for five days,the inhibitory effect on activity of nitrifying bacteria preparation was greater than on marine nitrifying bacteria preparation.In order to avoid the decrease of bacteria preparation activity because of frost,insulation measures should be taken to liquid nitrifying bacteria preparation during the transport and storage in winter.

Key words：nitrifying bacteria preparation; frost; activity; degradation rate

（收稿日期：2014-01-27）

圖4 冰凍對(duì)海水型硝化細(xì)菌制劑

亞硝酸鹽氧化細(xì)菌活性的影響

冰凍對(duì)于硝化細(xì)菌具有明顯的抑制作用，且抑制作用隨時(shí)間增長(zhǎng)而加強(qiáng)，主要是由于低溫形成的冰晶對(duì)細(xì)菌細(xì)胞具有傷害作用，細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰則對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞器乃至整個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌的影響要大于海水型硝化細(xì)菌，分析原因可能是海水型硝化細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)是在人工海水條件下進(jìn)行的，較高的離子強(qiáng)度對(duì)硝化細(xì)菌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。3 結(jié)論

冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌和海水型硝化細(xì)菌制劑活性均有較為明顯的抑制作用，且10 d處理組的抑制作用高于5 d處理組。

冰凍對(duì)淡水型硝化細(xì)菌制劑活性的抑制作用大于海水型硝化細(xì)菌制劑。

液體硝化細(xì)菌制劑在冬季運(yùn)輸和保存過(guò)程中要采取保溫措施，以避免由于冰凍導(dǎo)致的菌劑活性降低。

參考文獻(xiàn)：

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[4] 王歆鵬,陳堅(jiān),華兆哲,等.硝化菌群在不同條件下的增殖速率和硝化活性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),1999,5(1): 64-68

[5] Sudarno U,Winter J,Gallert C.Effect of varying salinity,temperature,ammonia and nitrous acid concentrations on nitrification of saline wastewater in fixed-bed reactors[J].Bioresour.Technol.,2011,102(10):5665-5673

[6] 劉冉,周洋,宋志文,等.硝化細(xì)菌對(duì)海參養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)的凈化效果[J].河北漁業(yè),2012（2）:15-18

[7] 宋志文,徐敏,溫少鵬,等.硝化細(xì)菌制劑對(duì)淡水水族箱水質(zhì)的凈化效果[J].河北漁業(yè),2007（7）:29-31

[8] 周洋,孔小蓉,宋志文,等.硝化細(xì)菌對(duì)海水水族箱硝化功能建立過(guò)程的影響[J].河北漁業(yè),2009（3）:4-6

[9] 吳偉,宋志文,于弘路,等.氨負(fù)荷對(duì)水族箱硝化功能建立過(guò)程的影響[J].河北漁業(yè),2010（11）:4-7

[10] 中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)部.水質(zhì)氨氮的測(cè)定納氏試劑分光光度法( HJ535-2009).北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,2009

[11] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法(第四版)[M].北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,2002

Effects of frost on the activity of nitrifying bacteria preparation

REN Jie1,ZHOU Yang2,KONG Xiao

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rong1,SONG Zhi

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wen1

(1. Qingdao Technological University, Qingdao 266033, China; 2.Management Office of Jihongtan Reservoir, the project of

water diversion from the Yellow River into Qingdao in Shandong, Qingdao 266111, China )

Abstract：Simulated conditions in the laboratory to study frost effects on activity of ammonia-oxidizing bacteria and nitrite-oxidizing bacteria in freshwater and marine nitrifying bacteria preparation.The results showed that frost had obvious inhibitory effect on activity of freshwater and marine nitrifying bacteria preparation.And the inhibitory effect on frost for ten days was greater than on frost for five days,the inhibitory effect on activity of nitrifying bacteria preparation was greater than on marine nitrifying bacteria preparation.In order to avoid the decrease of bacteria preparation activity because of frost,insulation measures should be taken to liquid nitrifying bacteria preparation during the transport and storage in winter.

Key words：nitrifying bacteria preparation; frost; activity; degradation rate

（收稿日期：2014-01-27）