間充質(zhì)干細胞聯(lián)合單倍體造血干細胞移植治療87例難治/復發(fā)惡性血液病臨床療效

吳亞妹，曹永彬，李曉紅，徐麗昕，劉周陽，劉 蓓，閆 蓓，楊雪良，李松威，樊世芬，達萬明，高春記，吳曉雄解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 血液科，北京 00048；解放軍總醫(yī)院 血液科，北京 00853

臨床研究

間充質(zhì)干細胞聯(lián)合單倍體造血干細胞移植治療87例難治/復發(fā)惡性血液病臨床療效

吳亞妹1，曹永彬1，李曉紅1，徐麗昕1，劉周陽1，劉 蓓1，閆 蓓1，楊雪良1，李松威1，樊世芬1，達萬明2，高春記2，吳曉雄1
1解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 血液科，北京 100048；2解放軍總醫(yī)院 血液科，北京 100853

目的回顧性分析難治/復發(fā)惡性血液病行臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)聯(lián)合單倍體異基因造血干細胞移植(haploidentical hematologic stem cells transplantation，haplo-HSCT)的臨床療效。方法總結(jié)解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院血液科2007年1月- 2013年12月住院收治的87例難治/復發(fā)惡性血液病進行UC-MSCs聯(lián)合haplo-HSCT治療的資料，觀察移植后細胞植入、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)發(fā)生率及嚴重程度和2年總生存率(overall survival，OS)、無疾病進展率(progression-free survival，PFS)及復發(fā)率。結(jié)果干細胞全部植入成功，無MSC回輸不良事件發(fā)生。白細胞及血小板植入時間分別為12(9 ～ 21) d及14(10 ～ 28) d；Ⅱ～Ⅳ度和Ⅲ～Ⅳ度aGVHD發(fā)生率分別為34.5%和18.4%，cGVHD發(fā)生率為46.5%，廣泛性僅為11.3%；2年OS、PFS和復發(fā)率為66.7%、62.9%及13.8%。59例存活，11例死于GVHD，9例死于感染，8例死于疾病復發(fā)。結(jié)論UC-MSCs聯(lián)合haplo-HSCT對難治/復發(fā)惡性血液病患者有效，是具有高危因素、無全相合供者患者的挽救治療選擇。

造血干細胞移植；單倍體；間充質(zhì)干細胞；白血病

目前，難治/復發(fā)惡性血液病因難緩解、耐藥、早期復發(fā)及低生存率等問題，治療效果非常不理想[1-2]。異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是惡性血液病及遺傳性疾病有效的治療手段，但人白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)配型要求高，供者受限，在中國HLA配型成功率＜30%。近20年，隨著移植方案的改進，單倍體異基因造血干細胞移植(haploidentical hematologic stem cells transplantation，haplo-HSCT)逐漸開展并取得一定臨床療效。但移植物植入不良、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)、免疫重建延遲及移植相關(guān)并發(fā)癥(transplantation-related toxicities，TRT)等問題使得haplo-HSCT仍面臨巨大治療風險[3-7]。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有自我更新、多向分化及低免疫原性，近期文獻報道其可促進干細胞植入，同時減少GVHD發(fā)生率及嚴重程度[8-11]。本文就解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院血液科完成的87例難治/復發(fā)惡性血液病患者行haplo-HSCT聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)治療情況進行總結(jié)分析。

資料和方法

1 資料 2007年1月- 2013年12月，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院血液科87例診斷為難治/復發(fā)惡性血液病的患者，有移植適應(yīng)證并自愿接受異基因造血干細胞移植，但無配型全相合同胞供者及骨髓庫無關(guān)供者。其中，急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)39例，急性淋巴細胞白血病34例，慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)(-AP/-BC期)5例，非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)9例；難治53例(60.9%)，復發(fā)34例(39.1%)；男性46例(52.8%)，女性41例(47.2%)。年齡4 ～ 58歲，中位年齡23歲；疾病診斷到haplo-HSCT的中位時間9個月，18例(20.7%)治療時間為13 ～ 24個月，11例(12.7%)治療時間＞25個月(表1)。HLA配型3個位點不和49例，2個位點不和23例，1個位點不和15例(表2)。UC-MSCs聯(lián)合haplo-HSCT治療難治/復發(fā)惡性血液病臨床研究方案通過解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查，所有入組患者或其監(jiān)護人均已簽署知情同意書并通過倫理委員會審查。

2 診斷標準 白血病的診斷依據(jù)法-美-英合作組織(French-American-British Cooperative Group， FAB)診斷標準，結(jié)合免疫分型及細胞遺傳學[12]。3 預處理方案 AML和CML患者采用方案1：氟達拉濱(fludarabine，F(xiàn)lu) 35 mg/(m2·d) -10 ～ -8 d，阿糖胞苷(arabinsyl cytosine，Ara-C) 2 g/(m2·d) -10 ～-8 d，白消安(busulfan，Bu)0.8 mg/(kg·6 h) -7 ～-5 d，替尼泊苷(VM-26) 300 mg/(m2·d) -4 d，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy) 1.8 g/(m2·d) -3 ～ -2 d，兔抗人胸腺免疫球蛋白(antithymocyte globulin，ATG)(費森尤斯，德國)5 mg/(kg·d) -4 ～ -1 d。對于急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)和NHL患者采用方案2：全身放射治療(total body irradiation，TBI) 1.8 Gy/(m2·d) -10 ～ -8 d，F(xiàn)lu 35 mg/(m2·d) -7～ -5 d，Ara-C 2 g/(m2·d) -7 ～-5 d，VM-26 300 mg/(m2·d) -4 d，Cy 1.8 g/(m2·d) -3 ～ -2 d，ATG 5 mg/(kg·d) -4 ～ -1 d(干細胞回輸日期定為0 d，干細胞回輸前日期定為-10 ～ -1 d)。特別指出：AML或CML患者如有髓外浸潤采用方案2，年齡＜10歲的ALL患者采用方案1。

表1 供患者移植前一般資料總結(jié)Tab. 1 Characteristics of patients and their donors before transplantation

表2 供患者HLA配型情況Tab. 2 Donor-recipient relationships and HLA histocompatibility

4 供者的骨髓采集及外周血動員、分離及回輸移植前5 d供者皮下注射惠爾血5 μg/(kg·d)，連用5 d。0 d采集供者骨髓，采集量600 ～ 800 ml，+1 d經(jīng)CS-3000血細胞分離機分離外周血單個核細胞。共采集單個核細胞數(shù)(mononuclear cell，MNC)≥6×108/kg，CD34+≥2×106/kg。新鮮制備的UC-MSCs訂購于漢氏聯(lián)合細胞工程中心。0 d供者骨髓干細胞回輸前4 h回輸?shù)谌経C-MSCs，輸注時間約30 min，UC-MSCs回輸數(shù)量為0.5×105/kg[1,5]。

5 GVHD預防 經(jīng)典的環(huán)孢素(cyclosporin，CSP)、驍悉及ATG，+4 d加用CD25單克隆抗體(舒萊20 mg)。

6 植入、GVHD分級及嵌合 中性粒細胞檢測值連續(xù)3 d≥0.5×109/L、血小板檢測值連續(xù)5 d≥20×109/L為白細胞及血小板植入期。GVHD分級依據(jù)格魯茲堡分級[8]。所有病人均在移植后30 d、180 d、365 d應(yīng)用短串連重復序列(STR2PCR)檢測移植后供患者嵌合情況，如供患者性別不和，同時檢測細胞遺傳學改變。

7 隨訪 第1年每隔3個月隨診1次，第2年每隔6個月隨訪1次。本組病人觀察截止至2013年12月31日。隨訪項目包括一般情況、皮疹、腹瀉、aGVHD、cGVHD、疾病持續(xù)緩解或復發(fā)狀態(tài)、尿常規(guī)指標、胸部CT、血常規(guī)指標、肝腎功能、心電圖。

8 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，Kaplan-Meier分析2年OS、PFS及復發(fā)率。

結(jié) 果

1 植入情況 87例輸入的MNC中位數(shù)為8.54(5.34 ～15.56)×108/kg，CD34+中位數(shù)為3.36(1.78 ～ 14.42)× 106/kg(表1)。干細胞全部植入成功，白細胞植入中位時間12(9 ～ 21) d，血小板植入中位時間為14(10 ～ 28) d(表3)。移植后所有患者均為100%供者型。

2 GVHD情況 移植后10 ～ 83 d 44例出現(xiàn)aGVHD，其中Ⅰ度14例(16.1%)，Ⅱ度14例(16.1%)，Ⅲ度8例(9.2%)，Ⅳ度8例(9.2%)。Ⅱ～Ⅳ度和Ⅲ～Ⅳ度aGVHD發(fā)生率分別為34.5%和18.4%。生存＞90 d的71例患者中33例(46.5%)出現(xiàn)cGVHD，其中廣泛型8例(11.3%)(表3)。對于GVHD應(yīng)用潑尼松龍(1 ～ 2 mg/kg)治療，依據(jù)病情或潑尼松龍反應(yīng)程度序貫減停；治療效果欠佳患者換用二線免疫抑制劑如FK-506，7例重癥患者加用CD25單克隆抗體治療。輕度GVHD治療均有效，17例Ⅲ～Ⅳ度重癥cGVHD及8例廣泛性cGVHD中14例治療有效，11例效果欠佳。

表3 半相合異基因造血干細胞移植后相關(guān)結(jié)果Tab. 3 Outcomes of haplo-HSCT and associated data

圖 1 移植后2年復發(fā)率(A)、無疾病進展率(B)及總體生存率(C)Fig. 1 Probability of relapse (A), PFS (B), OS(C) after 2 years

3 感染情況 感染的發(fā)生率56.3%，體溫＞37.3℃的持續(xù)時間為2 ～ 10 d，中位時間為5 d。經(jīng)碳氫酶烯類、萬古霉素、伊曲康唑或卡泊芬凈、膦甲酸鈉注射液等抗生素處理后發(fā)熱逐漸得到控制。干細胞植入后，臨床診斷侵襲性真菌感染30例(曲霉菌感染18例，白色念珠菌感染4例，非白色念珠菌8例)，擬診侵襲性真菌感染9例，給予抗真菌治療后好轉(zhuǎn)；合并巨細胞病毒(cytomegalo virus，CMV)感染48例(55.2%)，EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染36例(36.8%)，2例發(fā)展為CMV相關(guān)間質(zhì)性肺炎，1例發(fā)展為EBV相關(guān)移植后淋巴增殖性疾病(posttransplant lymphoproliferative disorders，PTLD)，余給予抗病毒治療后均好轉(zhuǎn)控制(表3)。

4 復發(fā)與預后 87例中9例(10.3%)2年內(nèi)復發(fā)，復發(fā)中位時間133(65 ～ 387) d，1例減停免疫抑制劑并回輸供者淋巴細胞后再次緩解，另8例治療無效，2年累積復發(fā)率為13.8%(圖1A)，2年P(guān)FS及OS分別為62.9%(圖1B)、66.7%(圖1C)。在移植后4 ～ 79個月，59例(67.8%)存活，11例死于GVHD，9例患者死于感染，8例死于疾病復發(fā)。

5 移植相關(guān)并發(fā)癥 87例均接受清髓預處理方案，其中15例(17%)出現(xiàn)Ⅲ～Ⅳ級移植相關(guān)不良事件(表4)。口腔潰瘍2例(2.3%)，腹瀉5例(5.8%)，消化道出血1例(1.1%)，出血性膀胱炎3例(3.4%)，間質(zhì)性肺炎1例(1.1%)，肝損傷2例(2.2%)。接受方案2的患者口腔潰瘍、腹瀉及間質(zhì)性肺炎不良事件發(fā)生率高于方案1組，可能與TBI治療相關(guān)，給予保護消化道黏膜、水化堿化及對癥治療后均獲得好轉(zhuǎn)。

表4 Ⅲ/Ⅳ級移植相關(guān)并發(fā)癥Tab. 4 Grade Ⅲ/Ⅳ TRT adverse events (n, %)

討 論

2004年，Le Blanc等[9]曾報道采用第三方來源的BM-MSCs治療1例常規(guī)免疫抑制療法無效的Ⅳ度腸道和肝aGVHD患者并且取得了很好的治療效果。Ai等研究表明非清髓單倍體造血干細胞移植中共輸入MSC可降低GVHD的發(fā)生率及嚴重程度。我們近期研究表明，對21例重型再生障礙性貧血患者，采用UC-MSCs與造血干細胞聯(lián)合移植，植入好，GVHD發(fā)生率及嚴重程度低[13]。Bensinger等[14]研究表明，在全相合造血干細胞移植中Ⅱ～Ⅳ及Ⅲ～Ⅳ aGVHD發(fā)生率分別為44% ～64%及16% ～ 26%，廣泛性cGVHD發(fā)生率為30% ～46%。本組研究中，Ⅱ～Ⅳ及Ⅲ～Ⅳ aGVHD發(fā)生率分別為34.5%及18.4%，廣泛性cGVHD發(fā)生率為11.3%，優(yōu)于以往研究結(jié)果。這表明采用ATG、CD25、CSA、MMF同時聯(lián)合UC-MSCs預防GVHD方案有效可行。

為了預防重度GVHD發(fā)生，以往haplo-HSCT預處理方案及免疫抑制應(yīng)用中，往往采用加大劑量的免疫抑制劑。過度免疫抑制往往導致植入延遲，甚至植入不良。本研究中，干細胞全部植入成功，白細胞植入及血小板植入中位時間分別為12 d和14 d，移植后嵌合率為100%供者型。與我中心全相合異基因造血干細胞移植細胞植入時間無明顯差異及延遲。既往研究表明，MSCs可分泌多種細胞因子促進造血，從而增強骨髓造血恢復[15-17]。難治/復發(fā)惡性血液病患者因既往接受化療次數(shù)多、骨髓微小殘留病灶不能清除或長期不能緩解，導致骨髓造血微環(huán)境明顯差于中低?；颊摺Ｎ覀儾捎酶牧嫉那逅桀A處理方案，無植入不良及失敗，在一定程度上也表明UC-MSCs在單倍體移植中起到的促進干細胞植入的作用。

對于難治/復發(fā)惡性血液病患者，采用單純化療方法長期生存率和治愈率低，預后極差[18]。2006年陸道培等[2]統(tǒng)計293例異基因造血干細胞移植病例，其中25例接受全相合HSCT和32例接受haplo-HSCT的高危組患者2年生存率分別為45%和47%。本組研究對于無HLA配型相合患者采用親緣單倍體造血干細胞及UC-MSCs聯(lián)合輸注，預處理中加用Flu、Ara-C及VM-26聯(lián)合改良的BU + CY或TBI + CY方案。治療結(jié)果表明，腫瘤細胞被有效清除。隨訪結(jié)果顯示，2年OS、PFS和復發(fā)率分別為66.7%、62.9%及13.8%，優(yōu)于既往研究結(jié)果。

綜上所述，UC-MSCs聯(lián)合單倍體異基因造血干細胞移植對難治/復發(fā)惡性血液病患者具有良好療效，是具有高危因素、無全相合供者患者的挽救治療選擇。

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Cotransplantation of haploidentical hematopoietic stem cells and umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) for patients with refractory/relapsed hematologic malignancy

WU Ya-mei1, CAO Yong-bin1, LI Xiao-hong1, XU Li-xin1, LIU Zhou-yang1, LIU Bei1, YAN Bei1, YANG Xue-liang1, LI Song-wei1, FAN Shi-fen1, DA Wan-ming2, GAO Chun-ji2, WU Xiao-xiong1
1Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China;2Department of Hematology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

WU Xiao-xiong. Email: xiongwuxiao@sohu.com

ObjectiveTo analyse the clinical effect of cotransplantation of haploidentical hematopoietic stem cells and umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) for patients with refractory/relapsed hematologic malignancy.MethodsClinical data about 87 patients with refractory/relapsed hematologic malignancy who underwent haploidentical hematologic stem cells transplantation (haplo-HSCT) at The First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital from January 2007 to December 2013 were summarized. The engraftment, graft-versus-host disease (GVHD), overall survival (OS), disease/progression-free survival (PFS) and relapse after 2 years were observed.ResultsAll patients given MSCs showed sustained hematopoietic engraftment without any adverse UC-MSC infusion-related reaction. The median time of transplantation of neutrophil＞0.50×109/L and platelet＞20×109/L engraftment was 12.0 days (9-21 days) and 14.0 days (10-28 days), respectively. GradeⅡtoⅣandⅢtoⅣ aGVHD was observed in 30 of 87 (34.5%) patients and 16 of 87 (18.4%), respectively. Chronic GVHD was observed in 33 of 71 (46.5%) patients and was extensive in 8 patients (11.3%). The probability that patients would attain 2-years OS, PFS and relapse was 66.7%, 62.9% and 13.8%, respectively. During follow-up for 1 to 79 months, 59 cases (67.8%) survived and 28 cases died, 9 patients died as a result of infection, 11 patients of GVHD and 8 patients of relapse.ConclusionCotransplantation of haploidentical hematopoietic stem cells and UC-MSCs has good treatment effect to refractory/relapsed hematologic malignancy, and also it is a good survival opportunity for high-risk patients.

hematopoietic stem cell transplantation ; haploid; mesenchymal stem cells; leukemia

R 556.5

A

2095-5227(2014)11-1081-06

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.11.001

時間：2014-07-30 10:27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140730.1027.001.html

2014-05-19

全軍醫(yī)學科技青年培育項目(13QNP179)

Supported by the Medical Science and Technique Training Foundation for Youths of the Chinese People's Liberation Army(13QNP179)

吳亞妹，女，碩士，主治醫(yī)師。專業(yè)方向：惡性血液病臨床及基礎(chǔ)研究。Email: rippleya@126.com

吳曉雄，男，博士，主任醫(yī)師，主任。Email: xiongwuxiao@sohu.com