雞卵巢中ANXA2基因表達調(diào)控研究

朱桂玉

泰山學院生物與釀酒工程學院,山東泰安271021

雞卵巢中ANXA2基因表達調(diào)控研究

朱桂玉

泰山學院生物與釀酒工程學院,山東泰安271021

ANXA2基因?qū)儆谀ぢ?lián)蛋白家族一員，N-末端區(qū)域包含調(diào)控PKC通路中酪氨酸和色氨酸兩種蛋白激酶磷酸化的位點，曾有研究發(fā)現(xiàn)ANXA2基因在高產(chǎn)蛋雞卵巢中出現(xiàn)了顯著性高表達。因此，本實驗利用熒光定量PCR方法，研究了ANXA2基因在雞卵巢和各等級卵泡中的表達規(guī)律，發(fā)現(xiàn)此基因在開產(chǎn)雞卵巢中表達升高，并隨卵泡發(fā)育表達上調(diào)，排卵后表達量出現(xiàn)顯著性下降。通過分離培養(yǎng)雞卵泡的膜細胞，添加促卵泡生長素（FSH）和促黃體素（LH）處理，提取細胞RNA和利用熒光定量PCR方法，發(fā)現(xiàn)此基因的表達升高與FSH的調(diào)控有關(guān)，卻與LH無關(guān)。此作用的具體分子機制，還待于今后進一步的研究。

熒光定量PCR;膜聯(lián)蛋白Ⅱ;雞;卵巢

膜聯(lián)蛋白(ANXA)是一類依賴Ca2+的磷脂結(jié)合蛋白家族，現(xiàn)已在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了13個膜聯(lián)蛋白亞家族成員。膜聯(lián)蛋白羧基端結(jié)構(gòu)域含有Ca2+結(jié)合位點和磷酸化位點，其中磷酸化位點區(qū)域保守，而鈣結(jié)合位點在不同膜聯(lián)蛋白中差異較大[1]。

細胞內(nèi)Ca2+濃度升高時，膜聯(lián)蛋白可溶性的單體會在胞質(zhì)中形成三聚體，在膜界面上集合成更有序的結(jié)構(gòu)。Ca2+是胞內(nèi)主要的第二信使之一，在動物繁殖過程中對精子獲能、頂體反應、卵母細胞成熟、受精及卵裂等一系列復雜的過程有非常重要的影響[2]。所以，在哺乳動物中，膜聯(lián)蛋白除了參與囊泡運輸、促進膜融合、調(diào)控炎癥反應及細胞分化等重要生物功能外，其在生殖方面的作用也已引起了人們的重視。

小鼠中，ANXA1可通過抑制磷脂酶A2的活性來影響精子的頂體反應、精卵融合等過程[3]。另外，制備的小鼠ANXA1多抗可使其體外受精率下降[4]。羊中，其頂體可能是ANXA1的儲備庫，此基因參與了羊精子與卵母細胞膜的融合啟動[5]。人中，ANXA4基因在卵巢癌中存在著異常表達[6]。

前期，本實驗室通過高通量Illusion/Solexa測序，以未開產(chǎn)的（6周齡）白來航雞卵巢為對照組，在開產(chǎn)的（23周齡）雞卵巢中篩選到了大量差異表達基因，其中包括ANXA2基因。另外，前期我們研究發(fā)現(xiàn)ANXA2基因在高產(chǎn)蛋雞卵巢中出現(xiàn)了顯著性高表達。因此，本實驗著重研究了ANXA2基因在雞卵巢發(fā)育中的表達規(guī)律以及促性腺激素對其表達調(diào)控作用，以期為雞產(chǎn)蛋性能的改良提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物未開產(chǎn)（6周齡）及開產(chǎn)（23周齡，規(guī)律產(chǎn)蛋2周以上）白來航雞各20只，宰殺后取整個卵巢和各級卵泡，迅速投入液氮，-70℃保存，用于RNA的提取及熒光定量PCR的表達分析等實驗。

1.1.2 主要試劑RNA提取試劑盒(Qiangen,USA)、SYBR Premix Ex Taq定量試劑盒(TaKaRa,Japan)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche,USA)、M199(Gibco,USA)、FSH與LH(Sigma,USA)。

1.2 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上雞ANXA2基因的mRNA序列(NM_205351.1)和持家基因GAPDH的mRNA序列(NM_204305.1)，在各自的跨外顯子區(qū)設(shè)計特異的熒光定量PCR引物，二對引物均由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1

表1 ANXA2和GAPDH基因的引物序列Table 1 Primers sequences of ANXA2 and GAPDH genes

1.3 RNA的提取與定量

根據(jù)Qiagen公司的RNA提取試劑盒說明，分別提取卵巢組織、各等級卵泡、等級卵泡（F2-F4）的顆粒細胞、膜細胞及促性腺激素（FSH和LH）處理前后膜細胞的RNA，用紫外分光光度計測定總RNA濃度及純度，A260/A280=1.8～2.0時，所得RNA-70℃保存，將所提取總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見所提取總RNA效果較好。

1.4 cDNA合成

根據(jù)Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，取1μg總RNA，以O(shè)ligo-dT18為引物，完成反轉(zhuǎn)錄反應，最后反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存。

1.5 實時熒光定量PCR(real–time PCR)

在Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀上進行熒光定量PCR分析，反應利用Takara的熒光定量PCR試劑盒進行，15μL體系包括cDNA2μL，引物0.1μL，Rox0.3μL，反應程序為95℃10 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s；72℃讀板，40個循環(huán)。構(gòu)建標準曲線，驗證所有引物的擴增效率，目的基因跟持家基因擴增效率均要達到90%～100%之間，檢看它們是否具有線性擴增的關(guān)系。以GAPDH為內(nèi)參，至少做6個重復，最后用2-△△CT的方法計算基因的表達相對量。

1.6 顆粒細胞、膜細胞的分離培養(yǎng)與激素處理

取產(chǎn)蛋高峰期母雞，處死后剖開腹腔，取下整個卵巢，放進盛有青鏈霉素的PBS液的滅菌燒杯中。根據(jù)Gilbert文獻[7]介紹方法，分別剝離排卵前等級卵泡（F2-F4）的顆粒細胞層和膜細胞層，剪碎后，分別加入0.1%Ⅱ型膠原酶，放入37℃CO2培養(yǎng)箱中進行消化。其中，顆粒細胞消化時間為6 min左右，膜細胞消化時間為20 min左右。然后，用200目銅網(wǎng)過濾離心，收集細胞沉淀，分別提取顆粒細胞和膜細胞的RNA，用于ANXA2基因定量表達分析。一部分膜細胞，按2×106密度接種于24孔培養(yǎng)板中，38℃靜置培養(yǎng)，CO2濃度5%，然后分別添加5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL的FSH與LH進行處理24 h，然后倒掉培養(yǎng)基，用PBS沖洗后裂解提取細胞中的RNA。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)用平均數(shù)和標準誤表示，不同組之間利用單因素方差ANOVA和鄧肯式檢驗進行，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 提取RNA的質(zhì)量鑒定

如圖1所示，總RNA的凝膠電泳結(jié)果顯示清晰的28S與18S條帶，說明RNA完整無降解。

圖1 總RNA電泳結(jié)果Fig.1 Gel electrophoresis of total RNA

2.2 ANXA2基因在雞不同發(fā)育階段卵巢組織中的表達

從圖2可以看出，ANXA2基因在未開產(chǎn)雞卵巢（6周齡）中表達較低，而在雞開產(chǎn)卵巢（23周齡）中出現(xiàn)了顯著性高表達（P＜0.05）。

2.3 ANXA2基因在雞開產(chǎn)卵巢各級卵泡中的表達

如圖3所示，ANXA2基因表達在小白卵泡（small-white follicle,SWF）中的表達較低，隨著卵泡發(fā)育成熟，其表達量在F1（the first-largest follicle）卵泡中出現(xiàn)了極顯著性增高，而排卵后卵泡（the first post-ovalutory follicle,POF1）表達量出現(xiàn)了顯著性下調(diào)（P＜0.05）。

圖2 ANXA2基因在不同發(fā)育階段雞卵巢組織中的表達，字母不同者表示差異顯著(P＜0.05),以下同F(xiàn)ig.2 The levels of ANXA2 gene expression in diff erent developmental stages of chicken ovary.Bars with different superscript letters are significantly d ifferent(P＜0.05),the same as below

圖3 ANXA2基因在雞卵巢不同等級卵泡中的表達Fig.3 The levels of ANXA2 gene expression in different developmental follicles of chicken ovary

2.4ANXA2基因在卵泡顆粒細胞和膜細胞中的表達

分離培養(yǎng)排卵前等級卵泡（F2-F4）中的顆粒細胞和膜細胞，如圖4所示，研究發(fā)現(xiàn)ANXA2基因在等級卵泡中的膜細胞出現(xiàn)了顯著性高表達，而在顆粒細胞中表達較低。

2.5 FSH和LH對ANXA2基因表達調(diào)控的作用

分離培養(yǎng)排卵前等級卵泡（F2-F4）的膜細胞，添加高、中、低三種不同濃度(ng/mL)的FSH和LH進行處理，24 h后，收集細胞，通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)三種濃度的FSH均能上調(diào)ANXA2基因的表達，用10 ng/mL的FSH處理后，出現(xiàn)了顯著性表達升高。與此相反，低和中等濃度的LH處理后，ANXA2基因的表達卻出現(xiàn)了顯著性下調(diào)，如圖5所示。

圖4 ANXA2基因在卵泡顆粒細胞和膜細胞中的表達(A)顆粒細胞;(B)膜細胞;(C)ANXA2基因在膜細胞和顆粒細胞中的表達(放大倍數(shù):200x)Fig.4 The level of of ANXA2 gene expression in the granulosa cells and theca cells (A)The granulosa cells;(B)The theca cells;(C)The expression ofANXA2 mRNA in the theca and granulose cells(The number of magnification:200x)

圖5 不同濃度的FSH和LH對ANXA2基因表達的影響Fig.5 Effects of different concentrations of FSH and LH on ANXA2 expression in theca cells

3 討論與結(jié)論

卵巢是雌性動物的重要生殖器官，卵巢的功能是產(chǎn)生卵以及類固醇激素。卵泡是卵巢結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，卵泡發(fā)育是一個伴隨著顆粒細胞增殖分化，內(nèi)膜細胞出現(xiàn)及卵母細胞成熟的過程。這個過程中各種因子和細胞相互作用，協(xié)同增殖和分化，間接或直接參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)生和發(fā)育直至排卵[8]。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，研究禽類卵巢以及卵泡發(fā)育調(diào)控機制對于提高家禽的繁殖性能，改善蛋禽的產(chǎn)蛋性能，提高生產(chǎn)效率具有重要意義[9]。

禽類卵巢與哺乳動物存在很大差別，成熟的禽類卵巢外觀象一串葡萄，含有發(fā)育不同階段的許多卵泡。性成熟后，排卵周期中的卵巢體積非常大，卵巢皮質(zhì)常含有4～6個伸向腹腔的體積依次遞減的最大直徑可達40 mm的等級卵泡（分別用F1、F2、F3…表示）和無數(shù)等級前小白卵泡（the small-white follicle,SWF），以及排卵后卵泡(the post-ovulatory follicle,POF)等卵泡組成[10]。在雞的產(chǎn)蛋期，為了維持每天的排卵進程，在一個產(chǎn)蛋序列中必須每天有一個卵泡從等級前卵泡池中被募集出來，進入排卵前的快速發(fā)育階段，直至發(fā)育成熟排卵。因此，鳥類成熟卵泡可能是高等脊椎動物中生長最快的結(jié)構(gòu)，小卵泡在幾天內(nèi)可增長150～200倍[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在雞中，隨卵巢和卵泡的發(fā)育成熟，ANXA2基因出現(xiàn)了顯著性上調(diào)表達，而排卵后其表達出現(xiàn)了顯著性的下調(diào)。在豬和大鼠中，Cui等[12]研究發(fā)現(xiàn)此基因也隨卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育進行了高表達，尤其是在減數(shù)分裂的生發(fā)泡期。Yang等曾以蛋雞和肉雞的母系雞卵巢為高產(chǎn)蛋率雞和低產(chǎn)蛋率雞模型，分別建立了兩個相應的CDNA文庫。最后，在高產(chǎn)蛋率雞卵巢中共篩選出了4個高表達的基因，其中就包括ANXA2基因[13]。有研究表明，ANXA2基因的羧基核心區(qū)包括Ca2+和F-肌動蛋白等重要因子的結(jié)合位點[14]，而卵母細胞的成熟尤其是第二次減數(shù)分裂的啟動恢復都需要Ca2+的參與。另據(jù)研究表明，ANXA2基因主要參與了細胞的胞吐、膜蛋白轉(zhuǎn)運、纖維蛋白溶解以及血管的形成等生理過程[15]。在雞中，從小白卵泡發(fā)育到最大卵泡，卵泡組織需要發(fā)生較大的動態(tài)變更，此過程要求細胞外基質(zhì)發(fā)生不斷的降解、重建和大量供應營養(yǎng)的新血管生成。因此，我們推測隨雞卵泡成熟發(fā)育表達上調(diào)的ANXA2基因，有可能在促進卵泡血管發(fā)育、激發(fā)卵母細胞成熟和卵泡細胞增殖等過程中起了重要作用。禽類排卵后的卵泡不形成真正的黃體，而是發(fā)生快速的吸收退化，這種退化對于下個卵子的排出及連續(xù)性產(chǎn)卵卻是必須的[16]。因此，我們推測ANXA2基因在排卵后卵泡表達顯著性下調(diào)可能與卵泡的這種退化吸收過程中不再需要大量胞外基質(zhì)的新建與新血管形成有關(guān)。

既然，ANXA2基因表達隨著卵泡發(fā)育成熟出現(xiàn)了顯著性升高，那么問題是究竟哪種因子上調(diào)了ANXA2基因的表達呢？眾所周知，F(xiàn)SH和LH是兩種調(diào)控卵巢發(fā)育的促性腺激素。雌禽中，F(xiàn)SH主要促進卵巢內(nèi)卵泡的生長和發(fā)育，增加卵泡壁攝氧量，促進沉積卵黃物質(zhì)，增加卵泡的重量和體積。研究發(fā)現(xiàn)，在雞產(chǎn)蛋期若注射FSH則可繼續(xù)促進卵泡的生長。產(chǎn)蛋率低下的母雞，注射FSH可增加小黃卵泡和大白卵泡的數(shù)量，減少閉鎖的小黃卵泡和大白卵泡的數(shù)量[17]。而LH主要作用是促進卵泡成熟和排卵，刺激孕酮的分泌。LH能夠誘導成熟卵泡顆粒細胞和膜細胞中cAMP的升高，刺激類固醇激素的合成。卵泡發(fā)育至12～15 mm時，顆粒細胞開始呈現(xiàn)對LH刺激的反應，而逐漸失去對FSH刺激的反應[18,19]。本實驗通過分離培養(yǎng)等級卵泡（F2-F4）膜細胞進行FSH和LH處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)適當濃度的FSH能夠顯著性刺激ANXA2基因上調(diào)表達，而LH卻對它的表達起了抑制作用。FSH和LH在雞卵巢中的精確而復雜的調(diào)控機制，使卵泡能正常發(fā)育而排卵，本試驗結(jié)果表明FSH和LH有可能利用了膜細胞中的不同的信號通路，激活了不同的轉(zhuǎn)錄因子，最終協(xié)同作用于ANXA2基因的轉(zhuǎn)錄激活與抑制。FSH和LH的受體FSHR和LHR都屬于G蛋白偶聯(lián)受體，其在膜細胞中的特異結(jié)合蛋白有可能傳導不同的信號來激活特異的轉(zhuǎn)錄因子[20]。今后，我們還將進一步分析ANXA2的啟動子序列中的順式作用元件，深入分析FSH和LH是如何達到相反的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的。

綜上所述，本實驗主要研究了ANXA2基因在雞卵巢成熟和卵泡發(fā)育中的表達規(guī)律，由于禽類卵巢和卵泡發(fā)育又受到自分泌－旁分泌的精準調(diào)節(jié)，本實驗表明卵泡膜細胞中ANXA2基因的上調(diào)受到了FSH的促進?？傊?，通過以上研究，我們希望能為更系統(tǒng)、全面的揭示家禽卵泡發(fā)育的分子調(diào)控機制，為篩選出有價值的DNA標記及改善雞的繁殖性能和提高的持續(xù)產(chǎn)蛋能力等提供一定的理論基礎(chǔ)。

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The Expression and Regulation of ANXA2 Gene in the Chicken Ovary

ZHU Gui-yu
Department of Biology Science and Technology,Taishan University,Tai-an 271021,China

ANXA2 is a family member of the membrane-bound proteins.The N-terminal region contains the tyrosine and threonine phosphorylation sites for protein kinase activation in PKC pathway regulations.Previous studies showed that ANXA2 gene is overexpressed in hens with high ovulation efficiency.This paper has studied the expression patters of ANXA2 gene during the chicken ovary and follicles development by the real-time PCR.The results showed that the expression of ANXA2 increased with the chicken ovary maturation.In hierarchy follicles,ANXA2 mRNA increased significantly as follicular development proceeds in pre-ovulatory follicles,reached the peak expression at the time of ovulation then decreased significantly after ovulation.Then,the theca cells of pre-ovulatory follicles were isolated,and treated with different concentrations of FSH or LH.We found that the theca cell ANXA2 expression was stimulated by FSH but not LH.The molecular mechanism of theANXA2 regulation in chicken ovary should be studied further.

Real-time PCR;ANXA2;chicken;ovary

S831.2

A

1000-2324(2014)03-0347-05

2013-03-12

2013-04-05

山東省自然科學基金(ZR2013CQ002)

朱桂玉(1976-),女,講師,主要從事動物繁殖育種工作.E-mail:zgy0706@163.com