鏈霉菌菌株F-1的鑒定及其對水稻紋枯病防效的初步測定

王巖,李國慶

1.臨沂大學地質古生物研究所,山東臨沂276000 2.華中農業(yè)大學植物科技學院,湖北武漢430070

鏈霉菌菌株F-1的鑒定及其對水稻紋枯病防效的初步測定

王巖1,2,李國慶2*

1.臨沂大學地質古生物研究所,山東臨沂276000 2.華中農業(yè)大學植物科技學院,湖北武漢430070

采用形態(tài)特征觀察及16S rDNA序列分析等方法，對分離自健康水稻植株的內生鏈霉菌菌株F-1進行了鑒定；采用對峙培養(yǎng)試驗測定了菌株F-1對水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）的拮抗作用，在離體水稻葉片和活體水稻植株上，測定了菌株F-1代謝產物對水稻紋枯病的防治效果。結果表明：菌株F-1與普特拉鏈霉菌（Streptomyces platensi）親緣關系最近，同源性達100%，且形態(tài)與培養(yǎng)特征、生理生化特性與普特拉鏈霉菌相符，故將其命名為普特拉鏈霉菌（Streptomyces platensi）F-1；其對水稻紋枯病菌有顯著的拮抗作用，其代謝產物導致水稻紋枯病菌頂端菌絲彎曲，菌絲體皺縮畸形；在離體葉片和活體水稻植株上，菌株F-1的培養(yǎng)物濾液能夠有效防治水稻紋枯病。普特拉鏈霉菌菌株F-1對水稻紋枯病具有較好的生防潛力。

普特拉鏈霉菌菌株F-1;鑒定;水稻紋枯病;生物防治

由茄絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起的水稻紋枯病是世界范圍內分布最為廣泛的水稻病害之一，一般可減產10～30%，嚴重時減產幅度可達50%[1]。在控制水稻紋枯病為害的多種防治方法中,利用有益微生物進行生物防治是一種經濟有效,且無副作用的防治方法。利用拮抗微生物防治水稻紋枯病，報道較多的是利用拮抗真菌和拮抗細菌。對水稻紋枯病生物防治研究最多的是拮抗細菌[2]。鏈霉菌是存在于土壤當中的一類重要的微生物類群，其可以產生豐富的次生代謝產物，是重要的天然抗生素來源，一些鏈霉菌代謝產生的抗生素類的次生代謝產物可以有效抑制水稻紋枯病的發(fā)生[3～4]。目前，利用分離自水稻植株的鏈霉菌對水稻紋枯病進行防效潛力測定，并對其進行種類鑒定，尚未見報道。鏈霉菌菌株F-1(StreptomycesplatensisF-1)是分離自湖北武漢地區(qū)水稻植株上的一株拮抗鏈霉菌，其水稻紋枯病菌等多種病原真菌均有較強的拮抗作用。本研究對鏈霉菌菌株F-1進行了種類鑒定，在離體水稻葉片和盆栽水稻植株上初步測定其代謝產物對水稻紋枯病的防治效果，探討其對水稻紋枯病的防病機制，評價其生防應用潛力。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

鏈霉菌菌株F-1分離于湖北武漢地區(qū)健康水稻植株，由華中農業(yè)大學植病生防實驗室保存。

1.2 種類鑒定

1.2.1 形態(tài)觀察用葡萄糖馬鈴薯瓊脂埋片培養(yǎng),28℃下分別培養(yǎng)7,14,21,28 d后,光學顯微鏡觀察基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲形態(tài)，掃描電子顯微鏡觀察培養(yǎng)7 d時的形態(tài)特征。

1.2.2 培養(yǎng)性狀將試驗菌株用接種環(huán)畫線接種于葡萄糖馬鈴薯瓊脂、高氏合成一號、酵母浸出物麥芽糖瓊脂、燕麥瓊脂、無機鹽淀粉瓊脂、甘油天冬氨酸瓊脂、察氏蔗糖瓊脂、葡萄糖酪氨酸瓊脂、葡萄糖馬鈴薯瓊脂等各測定培養(yǎng)基，28℃光照培養(yǎng)，3～14 d分別觀察記錄菌株生長情況，對照《鏈霉菌鑒定手冊》[5]記錄氣生菌絲、基內菌絲和可溶性色素的顏色變化。

1.2.3 生理生化特征將試驗菌株畫線接種于PDA培養(yǎng)基，分別在5～45℃（每5℃設一梯度）暗光培養(yǎng)，7 d后，觀察記錄其生長情況。參考《鏈霉菌鑒定手冊》測定淀粉水解、纖維素利用、明膠液化、牛奶凝固與胨化、H2S產生、碳源利用等生理生化特征。

1.2.4 16S rDNA序列分析總DNA的提取按CTAB法，PCR擴增產物使用以下引物：Primer A:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;PrimerB:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR反應體系(總體積50 μL):10×Buffer5.0 μL，dNTP(2 mmol/L)4.0 μL，Primer A(10 pmol/L)1.0 μL，PrimerB(10 pmol/L)1.0 μL，Taq酶(2 U/μL)0.4 μL，DNA模板(50 ng～1 μg)1.0 μL，去離子水37.4 μL反應條件：95℃5 min；95℃1 min，55℃1 min，72℃3 min，35個循環(huán)；72℃5 min。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR回收純化后的產物送北京奧科生物技術有限公司測序。

1.3 抗生作用

1.3.1 對峙培養(yǎng)試驗用接種環(huán)蘸取培養(yǎng)好的菌株F-1孢子，劃線接種于PDA平板兩側，28℃光照培養(yǎng)3 d，平板中央接種水稻紋枯菌菌絲瓊脂塊。28℃培養(yǎng)24 h，觀察在菌株F-1菌落和紋枯菌菌落之間產生的抑菌帶。分別挑取受抑制的紋枯菌頂端菌絲和對照紋枯菌頂端菌絲，乳酚棉蘭染色，光學顯微鏡下觀察菌絲特征。

1.3.2 菌株F-1液體培養(yǎng)濾液對水稻紋枯菌的抑制效果從菌株F-1菌落表面洗下孢子（孢子濃度為107個孢子/mL），按0.1%（V/V）的比例將菌株F-1孢子液接種至PDB液體培養(yǎng)液中，28℃振蕩培養(yǎng)（200 r/min）3 d后離心（10000 r/min,10 min），上清液用細菌過濾器過濾，得到含有抗真菌物質的鏈霉菌菌株F-1 PDB培養(yǎng)濾液，記為AFSPDB。將制備AFSPDB按10%比例（V/V）與PDA混合倒平板，冷卻后中央接種直徑6 mm水稻紋枯菌菌絲塊，28℃光照培養(yǎng)24 h,以加無菌水處理為對照。將處理組和對照組的紋枯菌頂端菌絲乳酚棉蘭染色，光學顯微鏡觀察菌絲狀況。在含有10%比例AFSPDB的PDA平板上鋪一層無菌玻璃紙，接種紋枯菌，28℃培養(yǎng)24 h，將附有頂端菌絲的玻璃紙剪成長寬各4 mm的小片，電鏡掃描觀察菌絲形態(tài)。以加無菌水處理為對照。

1.4 防效測定

1.4.1 離體葉片防效試驗盆栽水稻生長約40 d（水稻品種汕優(yōu)63，為水稻紋枯病感病品種），采集生理部位一致的健康水稻葉片，沖洗干凈，放入加有0.5%土溫20的自來水中潤濕葉表，剪取相同生理部位長約6 cm的水稻葉片，用AFSPDB均勻潤濕水稻葉片表面，放入無菌的培養(yǎng)皿（3片/皿），在同一端接種紋枯菌菌絲塊（直徑6 mm），28℃光照保濕培養(yǎng)，并于第1～6 d按0～4級標準（0級:葉片健康無癥狀；1級:1%～25%葉片發(fā)??；2級:26%～50%葉片發(fā)??；3級:51%～75%葉片發(fā)??；4級：76%以上葉片黃化，水漬狀枯黃）記錄各葉片紋枯病病害嚴重度。設6個重復，以無菌水處理做對照。

1.4.2 盆栽防效試驗選取新鮮、粗細均勻的水稻秸稈，剪成6 cm的小段放至三角瓶中，高壓滅菌后接種新鮮的水稻紋枯菌菌絲塊，28℃光照培養(yǎng)至水稻秸稈表面長滿水稻紋枯菌備用。盆栽水稻生長至第50 d時，將含有0.05%土溫20的AFSPDB均勻噴施到水稻植株上，分別以5%的井岡霉素乳油和無菌水處理為對照，每組處理設3個重復。室溫下水稻表面晾干后，在每簇水稻植株基部接種1根長有紋枯菌的稻稈，用半透明塑料袋罩住盆栽水稻的底部，留出中上部，溫室培養(yǎng)15 d后，按照0～9級標準記錄每株水稻的病害嚴重度（0級：健康無病害；1級：病斑面積小于葉鞘面積的1/4；3級：病斑面積小于葉鞘面積的1/2；5級：病斑面積大于葉鞘面積的1/2，水稻基部葉片（倒數第3、第4葉）；7級：病斑面積大于葉鞘面積的3/4，頂部葉片受到嚴重侵染；9級：病斑到達植株頂部，所有葉片被嚴重侵染，有些植株枯死[18]）。按以下公式計算水稻株發(fā)病率、病情指數和防病效果：

水稻株發(fā)病率＝發(fā)病總株數/接種總株數×100%

病情指數＝∑(各級發(fā)病株數×病級值)/(總株數×最高病級值)×100

防治效果＝(對照病情指數－處理病情指數)/對照病情指數×100%

2 結果

2.1 種類鑒定

2.1.1 形態(tài)特征菌株F-1在葡萄糖馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周后，氣生菌絲、基內菌絲均生長豐茂，無可溶性色素，孢子絲波曲或螺旋狀，孢子呈卵圓形或短桿狀，表面光滑，孢子直徑約1 μm。菌絲彎曲較多分枝，無橫膈膜，無斷裂（圖1）。

圖1 鏈霉菌菌株F-1菌落、孢子絲及孢子形態(tài)特征（PDA,28℃,7 d）A.菌落正面B.菌落背面C.孢子絲D.孢子鏈及孢子(SEM)Fig.1 Morphology of colony and conidia spores of Streptomyces platensis F-1 A.Obverse of colony B.Inverse of colony C.Spore hypha D.Spore chain and single spore(SEM)

2.1.2 培養(yǎng)特征菌株F-1在多數培養(yǎng)基上氣絲豐茂呈粉狀，孢子多為灰白到灰色。在多數培養(yǎng)基上均不產生色素，僅在甘油天冬氨酸瓊脂上7 d后漸有輕微色素產生（表1）。

表1 鏈霉菌菌株F-1不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征Table 1 Streptomyces F-1 cultural characteristics on different media

2.1.3 生理生化特征菌株F-1生長溫度范圍在10℃～40℃之間，最適宜生長的溫度為28℃～35℃。菌株F-1可使淀粉水解，在纖維素上不生長，明膠液化微弱，牛奶胨化可凝固，不產生H2S。該菌較好利用葡萄糖、麥芽糖、果糖、肌醇，可利用乳糖、甘油、甘露醇，不利用蔗糖山梨醇。

2.1.4 16S rDNA序列分析鏈霉菌菌株F-1 16S rDNAPCR產物在約1500 bp位置有一條明顯的電泳帶。將測序所得的16S rDNA序列根據測序結果,先利用BLAST搜索軟件從GenBank數據庫中調出的相關放線菌菌株的16S rDNA序列,選取同屬的10個菌株及類鏈霉菌屬（Streptomycoides），異壁鏈霉菌屬(Actinoalloteichus)放線菌屬（Actinomyces）的16S rDNA做同源性分析，利用DNAMAN軟件進行序列比對，并構建進化樹。從16S rDNA序列為基礎的聚類圖可以看出，所選鏈霉菌屬的14個種基本聚成4個主要的分支，放線菌屬的一個菌株獨自構成一支。待測鏈霉菌菌株F-1與Streptomyces platensis16S rDNA的同源性為100%,它們在聚類圖上聚在一起的置信度達到100%(圖2)。

圖2 鏈霉菌菌株F-1及相關菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree showing the relationship between Streptomyces platensis F-1 and related species based on 16S rDNAsequences

綜合形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀及生理生化性狀，將鏈霉菌菌株F-1定名為普特拉鏈霉菌(Streptomyces platensis F-1)，其16S rDNA序列已在GenBank數據庫中注冊，注冊號為EF583557。

2.2 抗生作用

28℃培養(yǎng)24 h后，在F-1菌落和紋枯菌菌落之間形成明顯的抑菌帶，寬度為10～15 mm。顯微觀察，對照菌落的紋枯菌頂端菌絲生長筆直，呈直角分枝；與鏈霉菌菌株F-1對峙培養(yǎng)的紋枯菌菌絲頂端彎曲，有的菌絲膨大，分枝異常呈銳角，明顯畸形，說明鏈霉菌菌株F-1代謝所產生的物質對水稻紋枯菌菌絲生長具有顯著的抑制作用。在28℃下培養(yǎng)1 d后，加無菌水的對照組紋枯菌幾乎長滿平板，其頂端菌絲生長旺盛，呈直角分支。加AFSPDB處理組的紋枯菌生長受到抑制，菌落變厚，邊緣菌絲出現腫大、彎曲、分支增多等異常形態(tài)（圖3）。電鏡掃描顯示：對照組紋枯菌菌絲生長均勻，伸展自然，菌絲體飽滿光滑，分支成典型的直角；與之相反，AFSPDB處理的紋枯菌菌絲不規(guī)則扭曲，菌絲體干癟皺縮，表面粗糙，分支較多（圖4）。

圖3 鏈霉菌菌株F-1液體培養(yǎng)濾液(AFSPDB）對水稻紋枯菌菌絲生長抑制作用A.對照水稻紋枯菌菌落形態(tài)B.對照水稻紋枯菌菌絲頂端菌絲顯微形態(tài)C.AFSPDB處理的水稻紋枯菌菌落形態(tài)D.AFSPDB處理的水稻紋枯菌菌菌絲頂端顯微形態(tài)標尺=100 μmFig.3 Effect of cultural filtrate of Streptomyces sp.F-1 on mycelial growth of Rhizoctonia solani A.R.solani culture treated with sterile distilled water B.Hyphal tips of R.solani from culture treated with sterile distilled water C.R.solani culture treated with AFSPDBand D.Hyphal tips R.solani from culture treated with AFSPDBBars=100 μm

圖4 鏈霉菌菌株F-1液體培養(yǎng)物濾液對水稻紋枯菌菌絲抑制作用的掃描電子顯微鏡觀察A.對照水稻紋枯菌菌絲形態(tài)B.AFSPDB處理的水稻紋枯菌菌絲形態(tài)Fig.4 SEM micrographs showing inhibitory effect of AFSPDBof Streptomyces sp.F-1 on Rhizoctonia solani A.Hyphal of R.solani from culture treated with sterile distilled waterB.Hyphal of R.solani from culture treated with AFSPDB

2.3 防效測定

2.3.1 離體葉片防效試驗試驗結果（表2）表明：鏈霉菌F-1 PDB培養(yǎng)物濾液對水稻紋枯病均有顯著的防效(P＜0.05)。例如，在接種培養(yǎng)第3 d時，無菌水對照處理組的水稻紋枯病嚴重度為2.2級，而鏈霉菌F-1 PDB培養(yǎng)物濾液處理組的水稻葉片病害等級為0.9，僅有零星病斑；第6 d時，無菌水處理的水稻葉片病害嚴重度接近4級，葉片黃化，潰爛，并且葉片上出現菌核，而鏈霉菌F-1 PDB培養(yǎng)物濾液處理組處理的水稻葉片病害嚴重度只有1.8級。

表2 鏈霉菌F-1培養(yǎng)物濾液（AFSPDB）對水稻紋枯病菌侵染的影響Table 2 Effect of the culture filtrate on infection of detached rice leaves by Rhizoctonia solani

2.3.2 盆栽防效試驗接種培養(yǎng)15 d后（表3），對照組發(fā)病率達到100%，水稻植株發(fā)病嚴重，病害嚴重度達到6.1級，病情指數達到67.7%，在莖基部接種水稻紋枯菌的附近區(qū)域，形成1～2 cm長的不規(guī)則水漬狀病斑，菌絲擴展到葉部，并引起葉部病斑并形成菌核。濃度為5%的井岡霉素乳油處理組，發(fā)病率為89.1，水稻病害嚴重度有所降低，為3.7級，病情指數為41.4。鏈霉菌菌株F-1液體培養(yǎng)濾液處理的水稻長勢旺盛，病害嚴重度較井岡霉素陽性對照進一步降低，僅有少量發(fā)病，發(fā)病率為34.3%，病害嚴重度僅為0.4，病情指數為4.5，與井岡霉素處理及無菌水對照均差異顯著(P＜0.05)。

表3 鏈霉菌菌株F-1液體培養(yǎng)物濾液與井岡霉素對水稻紋枯病的防治效果Table 3 Efficacy of the antifungal substances of Streptomyces platensis.F-1 and Jinggangmycin in suppression of R. solani on rice plants

3 討論與小結

本研究參照傳統(tǒng)的鏈霉菌分類鑒別方法對拮抗鏈霉菌菌株F-1的形態(tài)學和生理生化反應進行了觀察鑒定。對16S rDNA序列的比較分析可知，待測鏈霉菌菌株F-1與吸水鏈霉菌屬普特拉種群具有高度同源性和置信度，說明它們具有很近在親緣關系。因此，將菌株F-1定名為普特拉鏈霉菌菌株F-1（Streptomyces platensisF-1）。研究表明，普特拉鏈霉菌產生的次生代謝產物中，有一些對真菌具有拮抗性[7-9]。沈寅初及日本Som kyo發(fā)現的活性菌株,菌號為Streptomyces platensis SAN K6091，該菌株產生的抗生物質對多種植物病原菌有顯著的抗菌活性[10]。本研究首次報道了分離自健康水稻植株的普特拉鏈霉菌對水稻紋枯菌有顯著的拮抗作用。

鏈霉菌菌株F-1在PDA固體培養(yǎng)基及PDB液體培養(yǎng)基生長均可產生對水稻紋枯菌有拮抗作用的抗菌物質，顯微觀察結果表面，其對水稻紋枯菌的抑制效果相同，進而初步推測它們是相同的物質，這種物質可能有一種或幾種具有抑菌活性的成份組成[11-12]。離體和盆栽試驗結果表面，鏈霉菌菌株F-1孢子液及其液體培養(yǎng)物濾液均對水稻紋枯病有顯著防效，具有成為水稻紋枯病生防因子的潛力，類似前人報道的鏈霉菌PM5[13]，可提取其抗菌物質用于病害的防治。此外，鏈霉菌菌株F-1在液體和固體培養(yǎng)下均可產生揮發(fā)性物質，尤其在固體培養(yǎng)時其產生揮發(fā)性物質對水稻紋枯菌所引起葉片紋枯，核盤菌(Sclerotinia.sclerotiorum)所引起的油菜葉枯和灰霉菌（Botrytis cinerea）引起的草莓灰霉病均有顯著防效[14]，進一步增強了其生防潛力及開發(fā)利用價值。

拮抗放線菌生物防治病害的途徑主要有兩種途徑：一是寄生在植物組織體內，誘導植物自身產生抗病性或代謝出一些具有抑菌作用的活性物質（抗生素）影響病原菌的新陳代謝過程，從而達到防病治病的目的；二是在寄主體外利用[15]。本研究中，經鏈霉菌菌株F-1抗菌物質處理的水稻紋枯菌菌絲皺縮、干癟，水稻紋枯菌菌絲體內容物外泄。Olivia研究發(fā)現，一些抗菌物質能引起某些離子從菌體內釋放出來，從而引起細胞死亡[16]。離體拮抗試驗中，鏈霉菌菌株F-1產生的抗菌物質對水稻紋枯菌不是完全抑制，而是減慢其生長，說明鏈霉菌菌株F-1產生的抗菌物質只是對水稻紋枯菌細胞產生毒害，或是引起細胞內物質外泄后，導致細胞生長活力衰退，致病能力下降，而沒有將其殺死。根據以上結果初步推斷，鏈霉菌菌株F-1的防病機制之一是其產生的抗菌物質使水稻紋枯菌菌絲頂端彎曲畸形，生長速度大幅度減慢，導致了其致病力下降。這一結論與Moreno報道相一致[17]。

本研究表明，分離自健康水稻植株的普特拉鏈霉菌菌株F-1對水稻紋枯菌有較強拮抗性，其液體培養(yǎng)產生的抗菌物質在離體水稻葉片和盆栽水稻上均對水稻紋枯病具有顯著防效，對水稻紋枯病具有很好的防治潛力。

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Identification of Streptomyces platensi Strain F-1 and the Control Effect on Rice Sheath Blight

WANG Yan1,2,LI GUO-qing2*
1.Institute of Geology and Paleontology,Linyi University,Linyi 276000,China 2.College of Plant Science and Technology of Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China

Strain F-1 was identified by morphological and cultural traits,physio-biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis.Antagonistic interaction between strain F-1 and Rhizoctonia solani,was tested using the dual cultural method.Cultural filtrate of strain F-1 was determined for control of R.solani on in vitro rice leaves and on rice plants.The results showed that strain F-1 was most closely related to Streptomyces platensis(100%si milarity)by the 16S rDNA sequence analysis,the morphological and cultural traits,and physio-biochemical characte ristics of strain F-1 conformed with S.Platensis,so strain F-1 was affiliated to Streptomyces platensis F-1.It inhib ited growth of R.solani,resulting in hyphal malformation.Application of the culture filtrate of strain F-1 to rice d etached rice leaves and to potted rice plants reduced disease incidence caused by R.solani effectively.Strain F-1w as preliminarily identified as S.platensis F-1,and it is an effective agent against R.solani.

Streptomyces platensis F-1;identification;rice sheath blight;biological control

S435.115

A

1000-2324(2014)03-0321-07

2012-10-21

2012-11-04

國家自然科學基金項目(30570079);臨沂市科技發(fā)展計劃項目(201312024);2013年山東省高等學校青年骨干教師國內訪問學者項目(1413097)

王巖(1979-),女,講師,博士,主要從事生物學研究.E-mail:wangyan6696@lyu.edu.cn

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:guoqingli@mail.hzau.edu.cn