蠶絲人工肌腱止點(diǎn)轉(zhuǎn)歸的觀察

劉和風(fēng)，徐 華，王駿飛，陳東陽(yáng)，蔣 青

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院骨二科，安徽 巢湖 238000；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，江蘇 南京 210008）

蠶絲人工肌腱止點(diǎn)轉(zhuǎn)歸的觀察

劉和風(fēng)1，徐 華2，王駿飛2，陳東陽(yáng)2，蔣 青2

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院骨二科，安徽 巢湖 238000；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，江蘇 南京 210008）

目的 通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析蠶絲人工肌腱止點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程，評(píng)價(jià)腱骨愈合與腱腱愈合的生物學(xué)轉(zhuǎn)歸，進(jìn)一步研究蠶絲材料在骨科中應(yīng)用的可行性。方法 在兔脛骨中上1／3處鉆孔，實(shí)驗(yàn)側(cè)用脫膠的蠶絲，一端穿過(guò)骨道固定，另一端與趾長(zhǎng)屈肌腱在輕微張力下編織縫合；對(duì)照側(cè)以趾長(zhǎng)屈肌腱內(nèi)側(cè)1／3的近斷端穿過(guò)骨道固定。分別于術(shù)后6、12、24周獲取標(biāo)本，行 HE、甲苯胺藍(lán)及Ⅰ型和Ⅲ型膠原免疫組化染色，觀察蠶絲人工肌腱止點(diǎn)的組織學(xué)轉(zhuǎn)歸，與對(duì)照側(cè)相比，評(píng)價(jià)蠶絲人工肌腱與骨及腱愈合的生物學(xué)轉(zhuǎn)歸。結(jié)果 蠶絲人工肌腱與骨隧道逐漸形成膠原連接，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，愈合越明顯，以膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨的方式向正常肌腱止點(diǎn)轉(zhuǎn)歸的趨勢(shì)；亦發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原染色隨時(shí)間延長(zhǎng)從少到多，Ⅲ型膠原染色從多到少，具有與對(duì)照側(cè)自體肌腱移植相似的改變，但速度較慢。結(jié)論 蠶絲人工肌腱可以形成腱骨及腱腱愈合，日后加以改進(jìn)，有望成為一種新的骨科組織工程人工材料，具有良好的發(fā)展前景。

蠶絲；肌腱；組織工程；止點(diǎn)

文獻(xiàn)大量報(bào)道了組織工程肌腱、韌帶的實(shí)驗(yàn)研究，但應(yīng)用于臨床的報(bào)道甚少。眾多學(xué)者通過(guò)組織工程學(xué)方法來(lái)研究人工肌腱，探究如何解決臨床所面臨的肌腱重建問(wèn)題。研究［1-2］表明：絲素（脫膠的蠶絲）具有良好的機(jī)械性能和良好生物相容性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用和研究，研究結(jié)果表明修飾含精氨酸、甘氨酸和天門(mén)冬氨酸三種氨基酸（RGD）的聚合物后蠶絲能促進(jìn)細(xì)胞吸附、增生、分化及促進(jìn)腱骨愈合的能力。通過(guò)我們先前建立蠶絲人工腱止點(diǎn)轉(zhuǎn)歸動(dòng)物模型的方法［3］獲取標(biāo)本進(jìn)行研究，初步探討其腱骨愈合及腱腱愈合的生物學(xué)轉(zhuǎn)歸，探討蠶絲人工肌腱在骨科組織工程方面的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Ⅰ型膠原抗體（Sigma公司），Ⅲ型膠原抗體（Calbiochem公司），鼠兩步法檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋公司）。

1.2 蠶絲制備 用桑蠶絲編織成人工肌腱，0.5%的碳酸鈉（Na2CO3）溶液，100℃，30 min，脫膠兩次，洗凈，干燥。術(shù)前預(yù)先將人工腱用含 0.4 g丁胺卡那的生理鹽水浸泡30 min，備用。

1.3 手術(shù)方法 動(dòng)物模型的建立同我們先前的研究［3］。取新西蘭成年大白兔20只，體重2～3 kg，雌雄隨機(jī)。采取氟哌利多、氯胺酮肌注誘導(dǎo)麻醉后耳緣靜脈維持。術(shù)區(qū)備皮后嚴(yán)格消毒、鋪洞巾，以脛骨中上1／3為中心，作前側(cè)一約2 cm縱形切口，切開(kāi)筋膜、骨膜，以直徑2.0 mm克氏針在脛骨中上1／3處鉆孔。隨機(jī)以一側(cè)后肢作實(shí)驗(yàn)組，對(duì)側(cè)為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)側(cè)取人工肌腱一端穿過(guò)骨道后回轉(zhuǎn)，在輕微張力下以 1號(hào)絲線固定于穿過(guò)骨道前的蠶絲上，模擬臨床人工腱與骨固定要求，另一端與趾長(zhǎng)屈肌腱在輕微張力下編織縫合。對(duì)照側(cè)分離趾長(zhǎng)屈肌腱內(nèi)側(cè)1／3，在切口遠(yuǎn)側(cè)切斷，近端穿過(guò)骨道亦回轉(zhuǎn)，在輕微張力下以1號(hào)絲線固定。分層縫合切口。術(shù)后當(dāng)天及第1天，第 2天皆肌注丁胺卡那0.2 g，給予正?；顒?dòng)。術(shù)后按6、12、24周各處死大白兔6只并獲取標(biāo)本。

1.4 觀察方法 獲取標(biāo)本后，經(jīng)過(guò)修剪并用等滲鹽水沖洗、固定24 h以上（10%中性甲醛）、沖洗、脫鈣（10%乙二氨四乙酸二鈉，EDTANa2）、脫水、包埋成蠟塊、切片、染色觀察（HE、甲苯胺藍(lán)及Ⅰ、Ⅲ型膠原染色）。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照側(cè) 術(shù)后 6周：肉眼觀察肌腱形態(tài)良好，有部分黏連，未發(fā)現(xiàn)骨道中的移植肌腱組織壞死。HE染色可見(jiàn)移植肌腱內(nèi)有較多的排列紊亂的成纖維細(xì)胞分布，可見(jiàn)骨髓腔開(kāi)放伴纖維化，在肌腱與骨道處新的骨髓腔逐漸形成。移植物內(nèi)膠原分布的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：移植肌腱內(nèi)Ⅰ型膠原在成纖維細(xì)胞聚集處和移植物周邊分布顯著；Ⅲ型膠原的分布情況與Ⅰ型膠原分布結(jié)果類(lèi)似。

術(shù)后12周：肉眼觀察可見(jiàn)肌腱在骨道處明顯的腱骨愈合征，移植肌腱在骨道處形成與正常腱骨止點(diǎn)結(jié)構(gòu)相同的止點(diǎn)結(jié)構(gòu)。染色示移植物中細(xì)胞和纖維分布依然紊亂，但出現(xiàn)散在膜內(nèi)成骨。甲苯胺藍(lán)異染發(fā)現(xiàn)骨道出口處較多的軟骨內(nèi)成骨（圖1）。免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)移植物內(nèi)Ⅲ型膠原均勻分布，染色較淺。Ⅰ型膠原隨纖維排列分布。

圖1 對(duì)照側(cè)12周甲苯胺藍(lán)染色：×100，纖維軟骨（↖）呈異染性，其上方為肌腱及纖維組織，下方為骨組織，為纖維軟骨內(nèi)成骨

術(shù)后 24周：可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量顯著減少，移植腱骨止點(diǎn)結(jié)構(gòu)趨向正常并在隧道深部位的肌腱形成骨質(zhì)（圖2），甲苯胺藍(lán)異染發(fā)現(xiàn)在新形成的骨髓腔之間仍有部分軟骨性組織尚未成為骨質(zhì)。免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)Ⅰ型膠原染色深并均勻分布；Ⅲ型膠原染色淺，分布較不均勻（圖3）。

圖2 對(duì)照側(cè) 24周 HE染色：×100，骨道內(nèi)腱骨愈合，為膜內(nèi)成骨，骨化逐漸向肌腱側(cè)推進(jìn)

2.2 實(shí)驗(yàn)側(cè) 術(shù)后6周：在軟組織和骨道中的蠶絲呈嗜酸性，蠶絲中間部分未見(jiàn)細(xì)胞、其他細(xì)胞間質(zhì)及血管浸潤(rùn)，蠶絲周邊部分可見(jiàn)肉芽組織、大量成纖維細(xì)胞、新生毛細(xì)血管、少量巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的分布同肉芽組織，在成纖維細(xì)胞聚集處分布很明顯（圖4）。

圖3 對(duì)照側(cè) 24周Ⅲ型膠原免疫組化染色：×100，骨道內(nèi)膜內(nèi)成骨

圖4 實(shí)驗(yàn)側(cè)6周 I型膠原免疫組化染色：×200，蠶絲被 I型膠原和成纖維細(xì)胞包埋，左側(cè)蠶絲明顯變細(xì)（↖），表明部分已被降解

術(shù)后12周：在軟組織和骨道中的蠶絲中間部分呈嗜酸性，未見(jiàn)細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)及血管浸潤(rùn)；而蠶絲周邊部分呈嗜堿性，肉芽組織纖維化明顯，蠶絲通過(guò)纖維組織形成腱骨及腱腱愈合趨勢(shì)，但細(xì)胞減少，主要為成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，部分區(qū)域纖維軟骨化或骨化。甲苯胺藍(lán)染色可見(jiàn)骨道出口處部分包埋蠶絲的纖維組織開(kāi)始軟骨化。免疫組化可見(jiàn)Ⅰ型膠原包繞周邊部分的蠶絲，并與骨質(zhì)及肌腱中Ⅰ型膠原相延續(xù)，Ⅲ型膠原染色較淺（圖5），分布與Ⅰ型膠原一致。

術(shù)后 24周：在軟組織和骨道中蠶絲的中間部分呈嗜酸性，未見(jiàn)細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)及血管浸潤(rùn)。骨道蠶絲周邊部分呈嗜堿性，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，被纖維組織包埋，并逐漸軟骨化或骨化形成腱骨愈合趨勢(shì)（圖6，7）。在軟組織中蠶絲周邊部分被纖維組織包繞，亦呈嗜堿性，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，亦無(wú)軟骨化、骨化跡象（圖8）。甲苯胺藍(lán)染色示在骨道出口處以軟骨化的方式形成腱骨愈合。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示在蠶絲周邊部分 I型膠原分布均勻，排列有序，并與周?chē)琴|(zhì)或肌腱中 I型膠原相延續(xù)，染色較深；Ⅲ型膠原僅局部染色陽(yáng)性，染色淺。

圖5 實(shí)驗(yàn)側(cè)12周Ⅲ型膠原免疫組化染色：×100，蠶絲（↙）被Ⅲ型膠原和成纖維細(xì)胞包埋，形成較典型的止點(diǎn)：按蠶絲，纖維軟骨，軟骨鈣化，骨質(zhì)排列

圖6 實(shí)驗(yàn)側(cè)24周 HE染色：×100，蠶絲被骨質(zhì)包埋，呈嗜堿性，為膜內(nèi)成骨，右側(cè)蠶絲（←）已開(kāi)始降解變細(xì)

圖7 實(shí)驗(yàn)側(cè)24周 HE染色：×100，蠶絲（↙）與骨質(zhì)形成較典型的止點(diǎn)：按蠶絲，纖維軟骨，軟骨鈣化，骨質(zhì)排列

3 討論

自體肌腱存在著供體肌腱的解剖變異、新的創(chuàng)傷、原肌腱處功能受損、自體腱移植后可能有供體組織特異性存在等缺點(diǎn)［4］；同種異體肌腱移植也存在一些缺點(diǎn)：供體來(lái)源受限、排斥反應(yīng)、潛在的傳染性疾病感染、移植后遠(yuǎn)期效果不肯定。隨著醫(yī)學(xué)研究的深入，尤其是組織工程興起，人們逐漸聚焦于人工腱材料的研究。

圖8 實(shí)驗(yàn)側(cè)24周 HE染色：×100，蠶絲（↘）與肌腱間通過(guò)纖維連接

至今國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于蠶絲的研究結(jié)果。研究表明：絲素（脫膠的蠶絲）具有良好的機(jī)械性能和良好生物相容性，絲素蛋白對(duì)細(xì)胞有良好的吸附作用，且能促進(jìn)細(xì)胞增生、分化及腱骨愈合的能力［1-2，5］。把多股絲素纖維編織成帶，模擬前十字韌帶（ACL）的力學(xué)特性，在體外加骨髓基質(zhì)細(xì)胞（MSCs）培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，蠶絲不僅保持原有的良好機(jī)械性能和生物相容性，低降解率，而且促進(jìn) MSCs在基質(zhì)上黏附，分化，增殖，并分泌基質(zhì)（Ⅰ、Ⅲ型膠原和C型粘蛋白）［6］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)蠶絲人工腱植入后無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，生物相容性好；可以逐漸被自體肌腱組織代替，并能形成腱骨及腱腱愈合。人工腱中間部分蠶絲仍呈嗜酸性，無(wú)明顯細(xì)胞、血管浸潤(rùn)，與蠶絲編織太緊，無(wú)孔隙有關(guān)，有待改進(jìn)。

蠶絲可以作為骨組織形成的支架，Meinel等［7-8］應(yīng)用蠶絲作為人工材料，以人間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，骨形成蛋白（BMP-2）誘導(dǎo)細(xì)胞分化，體外構(gòu)建組織工程骨組織并進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，獲得成功。其后，他們又應(yīng)用腺病毒轉(zhuǎn)染人間充質(zhì)干細(xì)胞，使其表達(dá)BMP-2，并構(gòu)建人工骨組織也取得了較好的成果［9］。本研究發(fā)現(xiàn)蠶絲人工腱與骨隧道逐漸形成纖維連接，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腱骨愈合越明顯，并通過(guò)膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨的方式向正常肌腱止點(diǎn)轉(zhuǎn)歸的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)在腱骨愈合過(guò)程中，骨道中主要為膜內(nèi)成骨，骨道出口處主要為纖維軟骨成骨。王健等［10］研究發(fā)現(xiàn)：在后交叉韌帶重建中，移植物中Ⅰ型膠原含量隨時(shí)間的推移逐漸升高，移植物中Ⅲ型膠原表現(xiàn)為初期表達(dá)濃度低，中期表達(dá)濃度高且均勻，后期在局部呈表達(dá)濃度亦低。Ⅰ型膠原染色隨時(shí)間延長(zhǎng)從少到多，Ⅲ型膠原染色從多到少，具有與對(duì)照側(cè)自體肌腱移植相似的改變，但速度較慢。

本研究表明，蠶絲作為組織工程人工肌腱，有較好的腱骨及腱腱愈合，有形成正常肌腱止點(diǎn)的趨勢(shì)。日后對(duì)蠶絲加以改進(jìn)，可以成為一種新的骨科組織工程人工材料，應(yīng)用于人工肌腱、韌帶、半月板以及人工骨的研制。

在肌腱韌帶重建中，許多支架材料降解速度與新組織形成不匹配。體外實(shí)驗(yàn)表明［11］：在生物機(jī)械性能方面蠶絲相似于生物肌腱，且絲素具有較低的降解速度和生物相容性良好，1年后其抗張強(qiáng)度大部分下降，2年后在體內(nèi)的植入位點(diǎn)檢測(cè)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異體識(shí)別。本實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間有限，最長(zhǎng)僅 24周，為不足之處；形成正常肌腱止點(diǎn)的速度較對(duì)照組慢，也是需要改進(jìn)的地方。

隨著組織工程理論日益完善，技術(shù)不斷改進(jìn)，相信今后對(duì)蠶絲進(jìn)行合理改進(jìn)，解決種子細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題，加入適當(dāng)生長(zhǎng)因子，并施以符合條件的組織構(gòu)建，蠶絲人工腱修復(fù)肌腱缺損是一種指日可待的方法，蠶絲人工材料在骨科組織工程方面有著廣闊的前景。

［1］ Chen J，Altman GH，Karageorgiou V，et al.Human bone marrow stromal cell and ligament fibroblast responses on RGD-modified silk fibers［J］.J Biomed Mater Res A，2003，67（2）：559-570.

［2］ Kardestuncer T，Mc Carthy MB，Karageorgiou V，et al.RGD-tethered Silk Substrate Stimulates the Differentiation of Human Tendon Cells［J］.Clin Orthop Relat Res，2006，448：234-239.

［3］ 徐 華，蔣 青，王駿飛，等.蠶絲人工腱止點(diǎn)轉(zhuǎn)歸動(dòng)物模型的建立［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（5）：285-287，291.

［4］ Kleiner JB，Amiel D，Roux RD，et al.Origin of replacement cells for the anterior cruciate ligament autograft［J］.J Orthop Res，1986，4（4）：466-474.

［5］ Cai K，Yao K，Lin S，et al.Poly（D，L-lactic acid）surfaces modified by silk fibroin：effects on the culture of osteoblast in vitro［J］.Biomaterials，2002，23（4）：1153-1160.

［6］ Altman GH，Horan RL，Lu HH，et al.Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments［J］.Biomaterials，2002，23 （20）：4131-4141.

［7］ Meinel L，Betz O，F(xiàn)ajardo R，et al.Silk based biomaterials to heal critical sized femur defects［J］.Bone，2006，39（4）：922-931.

［8］ Meinel L，F(xiàn)ajardo R，Hofmann S，et al.Silk implants for the healing of critical size bone defects［J］.Bone，2005，37（5）：688-698.

［9］ Meinel L，Hofmann S，Betz O，et al.Osteogenesis by human mesenchymal stem cells cultured on silk biomaterials：Comparison of adenovirus mediated gene transfer and protein delivery of BMP-2［J］.Biomaterials，2006，27（28）：4993-5002.

［10］王 健，敖英芳.后十字韌帶重建后移植物組織學(xué)與膠原表型的變化［J］.中華骨科雜志，2006，26（1）：47-50.

［11］Altman GH，Diaz F，Jakuba C，et al.Silk-based biomaterials［J］.Biomaterials，2003，24（3）：401-416.

Outcome of silk artificial tendon insertion formation

LIU He-Feng1，XU Hua2，WANG Jun-fei2，et al
（1.Department of Orthopedic Surgery，Drum Tower Chaohu Hospital of Anhui Medical University，Chaohu，Anhui 238000，China；2.Nanjing Drum Tower Hospital The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School，Nanjing，Jiangsu 210008，China）

Objective To analyze the biological process of silk artificial tendon by animal experiment and to evaluate the biological outcomes of the healing of tendon to bone and tendon to tendon of silk artificial tendon insertion after implantation，so as to further investigate the feasibility of silk materials application in orthopedics.Methods New Zealand rabbit was treated by drilling in between the upper and middle third of tibia.At the experiment side，one extremity of silk fibers was fixed after threaded through the tibial tunnel，while the other extremity was taken and woven to the flexor digitorum longus muscle tendon；at the control side，the proximal end of one third of flexor digitorum longus muscle tendon was fixed after threaded through the tibial tunnel.The animal was sacrificed to get specimen in 6，12，24 weeks after operation.Standard HE stain，toluidine blue stain and immunohistochemical analysis of type I and III collagens monoclonal antibody were processed to observe histologically the outcome of silk artificial tendon insertion formation.The biological process of the healing of tendon to bone and tendon to tendon of silk artificial tendon insertion after implantation was also evaluated by comparison with the control side.Results The connection of artificial tendon to bone tunnel via collagens was more and more widespread with the gradual emergence of cartilaginous ossification and intramembranous ossification in fibrous tissue，along with time going on.There was a trend of normal tendon insertion formation.Immunohistochemistry result demonstrated that the staining of type I collagen in graft was low at first，then increased gradually；the staining of type III collagen was high at first，then decreased gradually.This change was similar to the control side which was tendon autograft，although slower.Conclusions Silk artificial tendon which has satisfactory consequence in the healing of tendon to bone and tendon to tendon may become a novel tissue engineered material in orthopedics and has good prospects if improved on in the future.

silk；tissue engineering；tendons；insertion

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.021

2013-11-27）

蔣 青，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：關(guān)節(jié)外科，E-mail：jiangqing112＠hotmail.com