17-Demethoxy-reblastatin聯(lián)合順鉑對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

趙 晴，劉 浩，趙素容，張 配，董清清，蔣琛琛，吳成柱

（蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蚌埠 233030）

17-Demethoxy-reblastatin聯(lián)合順鉑對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

趙 晴，劉 浩，趙素容，張 配，董清清，蔣琛琛，吳成柱

（蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蚌埠 233030）

目的 觀察17-Demethoxy-reblastatin（17-DR）聯(lián)合順鉑（cisplatin，DDP）對(duì)三陰性乳腺癌 （triple-negative breast cancer，TNBC）細(xì)胞株MDA-MB-231增殖和凋亡的影響及其相關(guān)的分子機(jī)制。方法 用MTT法、集落克隆形成法檢測藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物作用后細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果 不同濃度17-DR或DDP對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用，且二者聯(lián)用時(shí)抑制作用增強(qiáng)。50 μmol·L-117-DR、8 μmol·L-1DDP及二者聯(lián)用刺激24 h誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡率依次為14.7%、20.1%、45.2%。聯(lián)合用藥組Caspase-3的激活增強(qiáng)以及下調(diào)RIP1蛋白的表達(dá)。結(jié)論 17-DR作為熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）抑制劑能夠增強(qiáng)DDP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)Hsp90的顧客蛋白R(shí)IP1的表達(dá)相關(guān)。

Hsp90抑制劑；17-Demethoxy-reblastatin；順鉑；三陰性乳腺癌；凋亡

2006年 Bryan等首次明確提出雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體-2 （HER-2）均為陰性的乳腺癌為三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC），這一定義已被廣泛接受［1-2］，已成為 乳腺癌 研究 的 新熱 點(diǎn) 之 一。TNBC類患者約占全部乳腺癌的15%，發(fā)病年齡早，多見于絕經(jīng)前女性，且早期易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，增殖指數(shù)高，無病生存時(shí)間和總生存時(shí)間均較短，目前國內(nèi)外仍缺乏針對(duì)該特殊類型乳腺癌的規(guī)范化治療指南［3］。TNBC的ER、PR和 HER-2表達(dá)缺失，所以無法針對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行治療。而且TNBC具有典型的分子遺傳學(xué)特征，如BRCA1、EGFR、Eaveolin-1等基因分子突變或過度表達(dá)，這些異常有望成為今后 TNBC靶向治療的靶點(diǎn)。Synta制藥公司研發(fā)的一種熱休克蛋白 90（heat shock protein 90，Hsp90）抑制劑Ganetespib（STA-9090）正處于治療 TNBC的Ⅱ期臨床研究［4］。

17-Demethoxy-reblastatin（17-DR）是在首個(gè)確證的Hsp90天然抑制劑格爾德霉素（geldanamycin，GA）的基礎(chǔ)上，通過產(chǎn) GA菌株的突變菌株采用微生物發(fā)酵技術(shù)提取分離得到，研究已經(jīng)明確其為Hsp90 N末端抑制劑［5］（圖1）。Hsp90是分子伴侶中重要的一類，在癌基因蛋白的折疊、穩(wěn)定及成熟等過程中發(fā)揮著重要的作用。Hsp90在細(xì)胞內(nèi)以同型二聚體形式存在，每個(gè)亞單位都由3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：N-端的 ATP酶域，與顧客蛋白結(jié)合的中間域及包含蛋白與蛋白間相互作用和二聚化修飾的 C-端域［6］。由于 Hsp90 N末端有一個(gè)高度保守的 ATP結(jié)合位點(diǎn)，Hsp90發(fā)揮作用的機(jī)制包括 ATP結(jié)合到其N端結(jié)構(gòu)域及隨后的 ATP水解，Hsp90的伴侶活性需要ATP在這一位點(diǎn)的結(jié)合和水解。在 ATP結(jié)合的狀態(tài)下，Hsp90經(jīng)過了構(gòu)型的改變而變成成熟的復(fù)合體，這對(duì)發(fā)揮它對(duì)顧客蛋白的正確折疊及穩(wěn)定作用必不可少。ATP水解產(chǎn)生 ADP使這些顧客蛋白的釋放變得容易隨后它們通過泛素蛋白酶體途徑而降解［7］。

圖1 17-DR和格爾德霉素的結(jié)構(gòu)

Hsp90抑制劑通過抑制 Hsp90，可間接的調(diào)節(jié)癌基因蛋白從而發(fā)揮抗腫瘤作用，且 Hsp90抑制劑對(duì)癌細(xì)胞的作用相比正常細(xì)胞有顯著的選擇性［8］。臨床前研究顯示惡性乳腺癌組織相對(duì)于正常乳腺組織其細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核 Hsp90染色呈顯著的高水平，同時(shí) Hsp90 mRNA也呈高水平，另外高水平的Hsp90與乳腺癌患者的差預(yù)后也密切相關(guān)。

雖然TNBC對(duì)包括順鉑（cisplatin，DDP）在內(nèi)的鉑類等化療藥物較敏感但容易產(chǎn)生耐藥［9］，此外，研究顯示 DDP對(duì) Hsp90有很高的親和力，DDP能結(jié)合到Hsp90的 C末端結(jié)構(gòu)域并且抑制 Hsp90在C末端形成同源二聚體，導(dǎo)致 Hsp90蛋白的構(gòu)象改變，并能特異性抑制 Hsp90介導(dǎo)的分子伴侶活性［10-11］。而17-DR以及 GA類化合物是結(jié)合到Hsp90的N末端結(jié)構(gòu)域發(fā)揮其抑制作用，17-DR與DDP通過不同的機(jī)制抑制Hsp90介導(dǎo)的分子伴侶活性，理論上二者的聯(lián)合應(yīng)用將能夠更大程度的抑制Hsp90。因此本研究以TNBC細(xì)胞株 MDA-MB-231細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察了 Hsp90抑制劑 17-DR聯(lián)合DDP對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探究17-DR能否增強(qiáng)MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞，購于中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶：Gibco公司；胎牛血清：浙江四季青公司；MTT：Sigma公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）：沃宏公司；兔抗人 Caspase-3抗體：abcam公司；兔抗人 BCL-2、BAX抗體：中杉金橋公司；兔抗人RIP1抗體及鼠抗人 β-actin抗體：Santa Cruz公司；17-DR：韓國生命工學(xué)研究院（KRIBB）的Dr.Hong，Young-Soo惠贈(zèng)；DDP：山東齊魯制藥廠。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231采用DMEM培養(yǎng)液，含 10%胎牛血清，3.7 g·L-1碳酸氫鈉，1×105IU·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素，37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞存活率 取處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為 5×107·L-1，接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)設(shè)調(diào)零組（培養(yǎng)液、MTT、DMSO）、空白對(duì)照組（細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、DMSO）和藥物處理組（細(xì)胞、培養(yǎng)液、藥物、MTT、DMSO），每個(gè)組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。每孔中加100 μL含5 000個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液，在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)24 h之后，棄去每孔培養(yǎng)液，換新鮮含 10%胎

牛血清培養(yǎng)液，加藥后 24、48、72 h（藥物作用終點(diǎn)時(shí)間）終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)4 h，每孔加MTT 15 μL，4 h后棄去上清液，每孔加入 DMSO 100 μL，37℃孵育10 min，酶標(biāo)儀上振蕩5 min，用酶標(biāo)儀檢測波長570 nm處吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率／%：細(xì)胞存活率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組A值-調(diào)零組A值）／（對(duì)照組A 值-調(diào)零組 A值）×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 集落克隆實(shí)驗(yàn) 用含 10%胎牛血清的 DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度后，分別以每孔 1×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后吸棄培養(yǎng)液，5 μmol· L-117-DR、0.8 μmol·L-1DDP及兩者合用處理細(xì)胞，并設(shè)對(duì)照組，置CO2孵箱中培養(yǎng) 8 d，觀察到細(xì)胞集落形成后，去除培養(yǎng)基，預(yù)冷 PBS洗滌兩遍，20%甲醇于-20℃固定10 min，結(jié)晶紫染色，ddH2O緩慢洗去染色液，室溫下干燥，拍照觀察集落的形成情況。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞至 10 mL離心管，2 000 r·min-1，離心 10 min，去上清。用PBS洗滌一次并轉(zhuǎn)移到 5 mL離心管，2 000 r· min-1，離心5～10 min，去上清，各管分別加入冰上預(yù)冷的75%乙醇1 mL固定，置于4℃冰箱過夜。第二天取出各管，2 000 r·min-1，離心5 min，去上清。各管分別加3 mL PBS重懸，2 000 r·min-1，離心5 min，去上清。各管分別加入 600 μL的 PI染液染色，室溫，避光反應(yīng)30 min，上流式細(xì)胞儀（Becton Dicknson C6）進(jìn)行檢測，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。檢測具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞用細(xì)胞裂解液（總體積200 mL：100 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.4）20 mL、1mol·L-1NaCl 28 mL、100 mmol·L-1CaCl21 mL、100 mmol·L-1MgCl221 mL、15 mmol·L-1NaN340 mL、Triton X-100 2 mL、用前加入蛋白酶抑制劑 12 mmol·L-1Leupeptin、1 mmol·L-1PMSF各2 mL·L-1）冰上裂解 30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法（參照試劑盒說明書操作）測各組蛋白濃度，用細(xì)胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，與 2×上樣緩沖液 1∶1混合，100℃煮沸5 min變性。取蛋白40 μg每組，10%或15%SDS-PAGE凝膠電泳（70 V，30 min，90 V，90 min）；轉(zhuǎn)膜以恒流50 mA，轉(zhuǎn)移 2.5 h至 PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h（或4℃過夜）；PBS洗凈，孵一抗（1∶1 000），室溫孵育2 h（或4℃過夜）；TPBS洗滌3次，PBS洗滌1次；孵二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h；TPBS洗滌3次，PBS洗滌1次；ECL發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光、顯影、定影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)主要為計(jì)量數(shù)據(jù)，均行正態(tài)性檢驗(yàn)，以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較為單因素方差分析，各組間比較用雙側(cè)Dunnett t檢驗(yàn)。當(dāng) P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 17-DR增強(qiáng) DDP對(duì)乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231增殖的抑制作用 實(shí)驗(yàn)中使用不同濃度的 17-DR、DDP單用及 DDP聯(lián)合 17-DR刺激細(xì)胞，使用MTT法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果表明（圖2），不同濃度17-DR和 DDP單獨(dú)處理對(duì)細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用，17-DR和DDP作用細(xì)胞 72h的IC50分別為74.9、7.0 μmol·L-1。50 μmol·L-117-DR單用作用于細(xì)胞24、48、72 h的存活率分別為86.8%、76.2%、49.9%，8 μmol·L-1DDP單用作用于細(xì)胞24、48、72 h的存活率分別為79.7%、54.5%、37.3%，50 μmol·L-117-DR與不同濃度的 DDP聯(lián)用對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制較 DDP單用時(shí)作用增強(qiáng)。在DDP濃度為8 μmol·L-1和17-DR濃度為50 μmol·L-1兩者合用時(shí)，細(xì)胞24、48、72 h的存活率分別為46.3%、28.4%、25.4%，與單用組在相對(duì)應(yīng)濃度及時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)比較均有顯著性差異（P ＜0.05）。

圖2 17-DR、DDP及17-DR與 DDP聯(lián)用組對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 17-DR增強(qiáng) DDP對(duì)乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231集落克隆形成的抑制作用 為進(jìn)一步觀察 17-DR對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制作用及其對(duì)DDP抑制細(xì)胞增殖作用的影響，實(shí)驗(yàn)中根據(jù) MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用低于IC50的 5 μmol·L-117-DR和／或 0.8 μmol·L-1DDP刺激細(xì)胞，用集落克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比17-DR和 DDP單獨(dú)處理組均能抑制細(xì)胞的集落克隆形成，并且二者聯(lián)用時(shí)抑制作用增強(qiáng)（圖3）。

圖3 17-DR和／或DDP對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞集落克隆形成的抑制

2.3 17-DR增強(qiáng)DDP誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231凋亡的作用 實(shí)驗(yàn)中使用 50 μmol·L-117-DR、8 μmol·L-1DDP及 50 μmol·L-117-DR與8 μmol·L-1DDP聯(lián)用刺激誘導(dǎo)細(xì)胞24 h，隨后對(duì)實(shí)驗(yàn)中不同因素處理的細(xì)胞按照操作進(jìn)行 PI染色，通過流式細(xì)胞儀分析，觀察兩藥單用或合用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，各組的凋亡率用對(duì)應(yīng)Sub-G1期細(xì)胞所占的比例表示（圖 4）。50 μmol·L-117-DR、8 μmol·L-1DDP處理組誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡率分別為14.7%、20.1%與陰性對(duì)照組 1.1%比較有顯著性差異（P＜0.05）。用50 μmol·L-117-DR和8 μmol ·L-1DDP聯(lián)用組相同條件處理，誘導(dǎo) MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率增加到45.2%與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4 17-DR增強(qiáng) DDP誘導(dǎo) MDA-MB-231細(xì)胞Caspase-3蛋白的激活 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：17-DR刺激細(xì)胞后，并未出現(xiàn)明顯的 Caspase-3的激活，但 17-DR對(duì) DDP誘導(dǎo) MDA-MB-231細(xì)胞 Caspase-3的激活具有增強(qiáng)作用，Caspase-3蛋白裂解片段愈加明顯（圖5A）。

2.5 17-DR和／或 DDP處理對(duì)細(xì)胞 BAX、BCL-2及 RIP1蛋白表達(dá)的影響 細(xì)胞經(jīng)各處理組作用24 h后，Western blot結(jié)果顯示，促凋亡蛋白 BAX的表達(dá)為聯(lián)合用藥組高于單獨(dú)用藥組，抑凋亡蛋白 BCL-2的表達(dá)為聯(lián)合用藥組低于單獨(dú)用藥組。同時(shí) 17-DR可下調(diào)細(xì)胞RIP1的表達(dá)，DDP也能使 RIP1表達(dá)下調(diào)且二者合用組RIP1下調(diào)更明顯（圖5B）。細(xì)胞依次經(jīng)control組，17-DR組（50 μmol·L-1），DDP組（8 μmol·L-1），DDP（8 μmol·L-1）與17-DR（50 μmol·L-1）聯(lián)用組處理。圖5C中 a、b、c依次為BAX、BCL-2和 RIP1蛋白的表達(dá)灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果。*P＜0.05 vs control組。

圖4 17-DR增強(qiáng)DDP誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的敏感性注：A.control組；B、C、D：17-DR組（50 μmol·L-1），DDP組（8 μmol·L-1），DDP（8 μmol·L-1）與 17-DR（50 μmol· L-1）聯(lián)用組。

圖5 MDA-MB-231細(xì)胞Caspase-3、BAX、BCL-2和RIP1蛋白的表達(dá)情況及BAX、BCL-2和RIP1蛋白的表達(dá)灰度值統(tǒng)計(jì)

3 討論

目前已有多種 Hsp90抑制劑進(jìn)入治療乳腺癌臨床試驗(yàn)階段［12］，另有多個(gè) Hsp90抑制劑在臨床前乳腺癌研究中也顯示出較好的作用，通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)的一種新型的口服 Hsp90抑制劑 PF-4942847，在多個(gè)TNBC細(xì)胞株及異種移植模型的體外和體內(nèi)試驗(yàn)中，顯示了顯著的抗腫瘤活性［13］。Hsp90抑制劑用于治療包括TNBC在內(nèi)的乳腺癌具有良好的應(yīng)用前景。GA能夠與ATP競爭結(jié)合Hsp90 N末端而使 Hsp90的顧客蛋白不能受到處于關(guān)閉狀態(tài)的 Hsp90二聚體的保護(hù)，繼而通過泛素蛋白酶體途徑降解。雖然，GA具有較好的抗癌活性，但由于GA水溶性差，肝毒性強(qiáng)，使其在臨床應(yīng)用上受到了很大限制。因此，開發(fā)水溶性更好、毒副作用更低的GA衍生物成了 GA開發(fā)研究的主要方向。微生物因代謝產(chǎn)物豐富而成為了目前研究Hsp90抑制劑的主要來源，17-DR通過組合生物合成技術(shù)針對(duì)引發(fā)肝毒性結(jié)構(gòu)，即苯醌結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，制備得到的具有非苯醌結(jié)構(gòu)的GA衍生物［5］。腫瘤細(xì)胞中大多數(shù)與逃避細(xì)胞凋亡及對(duì)生長抑制信號(hào)失去敏感性有關(guān)的蛋白的穩(wěn)定性依賴于Hsp90，Hsp90可以調(diào)控多種信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)上的蛋白的折疊，在腫瘤的發(fā)展和惡化中扮演著重要的角色。以 Hsp90為靶點(diǎn)的大多數(shù)藥物比選擇性的致癌基因通路抑制劑具有更大的優(yōu)勢，因此以整個(gè)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)而不是單一的信號(hào)通路為靶向的藥物設(shè)計(jì)，可能會(huì)解決這一問題。

DDP是具有細(xì)胞毒性的細(xì)胞周期非特異性藥物，是目前最常用的抗腫瘤藥物之一，它物美價(jià)廉，治療效果良好，臨床中主要以靜脈注射和腹腔用藥的治療效果最為明顯，其主要作用部位在DNA的嘌呤和嘧啶堿基，可抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過程，并損傷其細(xì)胞膜上結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用，骨髓抑制作用較輕，在多種實(shí)體瘤的治療中 DDP是有效的抗腫瘤藥，但是能夠?qū)е履I毒性。研究表明Hsp90抑制劑 PU-H71和 DDP二者聯(lián)用下，能夠極大增強(qiáng)對(duì) PU-H71抵抗癌細(xì)胞株對(duì)誘導(dǎo)的凋亡的敏感性［14］。但是DDP又是一種由濃度決定其治療效果的抗腫瘤藥物，在短時(shí)間內(nèi)，每次給藥的濃度越高，效果也越好，但隨著用藥量的增加，出現(xiàn)的不良反應(yīng)亦相應(yīng)的增加。因此，本實(shí)驗(yàn)使用低濃度 DDP單用或與17-DR合用誘導(dǎo)細(xì)胞24 h為主，亦是基于以上原因，從而使實(shí)驗(yàn)研究與臨床的治療聯(lián)系更加密切。

RIP1為絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，是一種重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。它不僅參與了細(xì)胞的凋亡，還參與了細(xì)胞存活、細(xì)胞程序性壞死等多種信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)并在其中起關(guān)鍵作用，其功能受泛素化、鋅指蛋白及Hsp等的調(diào)節(jié)。

本課題組Huang等［15］的研究已經(jīng)表明在乳腺癌中己糖激酶抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）可以通過下調(diào)RIP1增加TRAIL誘導(dǎo)的凋亡，從而達(dá)到抑制 TNBC細(xì)胞的作用，顯示RIP1在乳腺癌中起重要的作用。

RIP1蛋白已經(jīng)明確為 Hsp90的顧客蛋白，RIP1在多個(gè)組織內(nèi)表達(dá)，是各種膜整合細(xì)胞內(nèi)外應(yīng)力信號(hào)必需的傳感蛋白，它除了能激活 NF-κB對(duì)抗凋亡外，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，包括凋亡和非Caspase依賴的壞死［16］。Hsp90可以與 RIP1結(jié)合，是 RIP1發(fā)揮作用的輔助分子。Hsp90的功能抑制劑 GA會(huì)導(dǎo)致RIP1的降解，隨后抑制了 TNF誘導(dǎo)的 NF-κB激活，使細(xì)胞對(duì)TNF誘導(dǎo)的凋亡更加敏感。用 GA的類似物17-DMAG處理乳腺癌細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi) RIP1的表達(dá)下降，細(xì)胞對(duì) TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加敏感，表明Hsp90在維持 RIP1的穩(wěn)定性和可溶性方面發(fā)揮著重要作用［17-18］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在 MDAMB-231細(xì)胞中RIP1蛋白高表達(dá)，17-DR能下調(diào)細(xì)胞RIP1蛋白的表達(dá)，可能通過減少NF-κB激活的途徑來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示 17-DR能增強(qiáng) DDP對(duì) MDAMB-231細(xì)胞的增殖抑制作用，同時(shí)17-DR增強(qiáng)DDP對(duì) MDA-MB-231細(xì)胞集落克隆形成的抑制作用，17-DR也增強(qiáng)DDP誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的作用。其機(jī)制可能是通過下調(diào)Hsp90的顧客蛋白R(shí)IP1，以及17-DR增強(qiáng)DDP誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞Caspase-3蛋白的激活，導(dǎo)致抑凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)使促凋亡蛋白BAX的表達(dá)增加相關(guān)。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，其激活的增強(qiáng)也表明17-DR和 DDP在相應(yīng)作用濃度下二者聯(lián)用是有效的。另外 BAX過度表達(dá)時(shí)細(xì)胞凋亡增多，而BCL-2過度表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)物可與 BAX結(jié)合，從而抑制了凋亡［19］。RIP1作為細(xì)胞死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中重要的上游信號(hào)蛋白，對(duì)其表達(dá)水平的改變?cè)谝欢ǔ潭壬蠀⑴c了細(xì)胞凋亡的調(diào)控。17-DR增強(qiáng) DDP抗腫瘤作用機(jī)制比較復(fù)雜，是否還有其它作用機(jī)制參與，有待進(jìn)一步研究。且本實(shí)驗(yàn)中僅選用了體外培養(yǎng)的細(xì)胞株進(jìn)行觀察，進(jìn)一步的體內(nèi)外藥效及機(jī)制研究有待深入。

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《安徽醫(yī)藥》2012年影響因子為1.045，在全國117家醫(yī)藥綜合類期刊中名列第5位，創(chuàng)歷史新高（數(shù)據(jù)由2013年版中國科技期刊引證報(bào)告擴(kuò)刊版提供）。

《安徽醫(yī)藥》編輯部

Effects of 17-Demethoxy-reblastatin combined with cisplatin on proliferation and apoptosis of triple-negative breast cancer cell line

ZHAO Qing，LIU Hao，ZHAO Su-rong，et al
（Faculty of Pharmacy，Bengbu Medical College；Anhui Engineering Technology Research Center of Biochemical Pharmaceuticals，Bengbu，Anhui 233030，China）

Objective To investigate the effects of 17-Demethoxy-reblastatin（17-DR）combined with cisplatin（DDP）on the proliferation and apoptosis of triple negative breast cancer MDA-MB-231 cell line，and to explore the molecular mechanisms underlying.Methods The inhibition of cell proliferation was examined using MTT assay and colony formation assay，and the apoptosis analyzed using flow cytometry.Results Treatment with 17-DR or DDP inhibited the proliferation of the cell，and the cell viability in the combined treatment group was lower than 17-DR or DDP group alone.The apoptosis rates were 14.7%，20.1%，and 45.2%following treatment with 50 μmol·L-117-DR，8μmol·L-1DDP and combined treatment for 24 h，respectively.The combined treatment enhanced the activition of Caspase-3，and down-regulated the expression of RIP1.Conclusions As a heat shock protein 90（Hsp90）inhibitor，17-DR，could enhance DDP-induced cell death.The underlying mechanism may relate to down-regulating the expression of Hsp90 client protein RIP1.

heat shock protein 90 inhibitor；17-Demethoxy-reblastatin；cisplatin；triple-negative breast cancer；apoptosis

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.007

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No 81372899）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No 81302671）；安徽省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No 1408085QH162）；蚌埠醫(yī)學(xué)院科技發(fā)展基金重點(diǎn)項(xiàng)目（No BYKF12A03）

趙 晴，男，碩士研究生

劉 浩，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生化藥理，E-mail：liuhao6886＠foxmail.com

2013-09-20，

2013-11-19）