混合菌群合成聚羥基脂肪酸酯研究進展

劉英杰，賈曉強，2，3，聞建平，2，3，班睿

（1天津大學化工學院生物工程系，天津 300072；2天津大學系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072；3天津大學天津化學化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072）

混合菌群合成聚羥基脂肪酸酯研究進展

劉英杰1，賈曉強1，2，3，聞建平1，2，3，班睿1

（1天津大學化工學院生物工程系，天津 300072；2天津大學系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072；3天津大學天津化學化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072）

聚羥基脂肪酸酯（PHA）是微生物體內(nèi)合成的可生物降解塑料，可以作為化學塑料的替代品。利用純培養(yǎng)微生物發(fā)酵的合成方法由于使用葡萄糖等優(yōu)質(zhì)底物及過程需滅菌等原因，產(chǎn)品成本較高，嚴重制約了PHA的廣泛使用；混合菌群利用廢棄物合成PHA有效降低了純培養(yǎng)方法的生產(chǎn)成本，因此受到人們越來越多的關(guān)注。本文對混合菌群合成PHA的歷史沿革、合成原理、生產(chǎn)工藝、提取方法等方面進行了系統(tǒng)綜述?；仡櫫嘶旌暇汉铣蒔HA的發(fā)展歷程，簡述了兩種主要的合成機理，介紹了不同底物合成PHA的代謝途徑，重點闡述了混菌合成PHA的三段式工藝和產(chǎn)物提取方法，同時也對新近的研究動態(tài)進行了分析總結(jié)。指出提高混菌濃度與利用實際廢棄物的能力將成為未來研究的關(guān)鍵。

聚羥基脂肪酸酯；可生物降解性；混合菌群；生物技術(shù)；聚合物；合成

聚羥基脂肪酸酯（PHA）是當碳源過量而營養(yǎng)元素如N、P、S、Mg等不足時在細菌內(nèi)合成的碳源能源儲藏顆粒。l925年法國巴斯德研究所的Lemoigne首次在巨大芽孢桿菌細胞中發(fā)現(xiàn)聚羥基丁酸酯（PHB）顆粒[1]，到目前已經(jīng)分離得到300多種微生物可以合成至少有150種不同單體結(jié)構(gòu)的PHA，并且還在不斷地發(fā)掘出新的單體結(jié)構(gòu)的PHA[2]。PHA具有可再生、可生物降解、生物相容、光學活性等特性，成為塑料的良好替代品，可以應用于各種可降解包裝材料，在生物醫(yī)藥、海洋環(huán)境、建材、農(nóng)業(yè)以及食品加工中也有廣泛的市場。

目前，PHA主要采用純種發(fā)酵生產(chǎn)，所使用的微生物包括產(chǎn)堿桿菌、固氮菌、假單胞菌以及重組大腸桿菌等，胞內(nèi)PHA最高含量可達細胞干重的90%[3]。但純種發(fā)酵需使用葡萄糖等優(yōu)質(zhì)底物，以及滅菌等發(fā)酵控制工藝造成其生產(chǎn)成本昂貴，高于傳統(tǒng)塑料的4～9倍[4]。高昂的價格嚴重阻礙了PHA的市場需求和使用，以至于PHA只能用于生物醫(yī)藥及化妝品等一些特殊領(lǐng)域，不能實現(xiàn)其塑料替代品的使命。為了降低PHA的生產(chǎn)成本，人們進行了大量的研究工作。其中使用混菌進行PHA生產(chǎn)成為一個不錯的選擇[5]。與微生物純種發(fā)酵需要使用高品質(zhì)底物不同，混菌發(fā)酵可以使用廉價底物甚至廢棄物進行PHA生產(chǎn)；混菌發(fā)酵使用開放系統(tǒng)無需滅菌，發(fā)酵控制等工藝也相對簡單；此外，不同于單菌大多只能生產(chǎn)單一結(jié)構(gòu)PHA，而混菌發(fā)酵產(chǎn)物為聚羥基丁酸（PHB）、聚羥基戊酸（PHV）等的共聚物，其性能有了顯著提高，使用范圍更加廣泛。因此混菌合成PHA的研究引起了人們極大的興趣。本文綜述了混合菌群使用廉價底物合成PHA的發(fā)展歷程，并展望了未來的研究方向。

1 合成機理

1974年，在厭氧好氧交替模式的生物除磷脫氮工藝中最早發(fā)現(xiàn)混菌可以合成PHA[6]。該系統(tǒng)中主要存在兩種類型細菌：聚磷菌（PAOs）和聚糖菌（GAOs）。兩者都具有特殊的能量供給方式，在能量相對較低的厭氧階段比其他微生物能更有效地攝取基質(zhì)，分別通過ED和EMP途徑分解糖原合成PHA類物質(zhì)；而在好氧階段，積累的PHA被作為碳源和能源物質(zhì)維持生命代謝活動，從而在厭氧好氧交替運行中成為優(yōu)勢菌群[7]。不同的是，PAOs還參與了磷酸的循環(huán)而GAOs只能通過分解糖原獲得能量。后來人們在好氧污水處理工藝中也發(fā)現(xiàn)了活性污泥可以合成PHA，為解釋該機理人們模擬了該工藝的條件，提出飽食饑餓模式，該模式后來獲得普遍接受，并在SBR反應器中進行PHA的生產(chǎn)和研究。關(guān)于飽食饑餓模式的解釋最被認可的是PHA合成由于胞內(nèi)缺乏生長所需酶或者RNA[5]。持續(xù)周期性的飽食饑餓可以使細胞內(nèi)部用于生長的酶和RNA含量降低，飽食期時，由于這部分酶和RNA不能馬上恢復造成細胞生長受抑制，細胞選擇進行儲藏PHA。

PHA積累一般都可以歸結(jié)為生長受阻，厭氧好氧模式中細胞積累PHA是由于外部生長抑制（缺乏氧、氮等）；飽食饑餓模式中PHA積累由于內(nèi)部生長抑制（生長相關(guān)酶或者RNA不足）。特殊的，有些混合菌群可以在不存在生長抑制情況下合成PHA[8]，事實上，一旦具有PHA合成能力的微生物分離出來，便可以同時進行生長和PHA積累。

2 代謝途徑

雖然還沒有關(guān)于混菌合成PHA代謝途徑的報道，一般認為混菌的代謝途徑與單菌一致[5]。具體代謝途徑如圖1所示。乙酸是最容易合成PHA的底物，首先乙酸活化變成乙酰輔酶A，然后兩分子乙酰輔酶A縮合成羥酰輔酶A（此處為丁酰輔酶A），最后丁酰輔酶A在PHA合成酶作用下聚合成PHB。丙酸可以活化變成丙酰輔酶A，兩分子丙酰輔酶A縮合成3-羥基2-甲基輔酶A，最后合成P(3H2MV)（聚3-羥基2-甲基戊酸，PHA的一種）。當乙酰輔酶A和丙酰輔酶A同時存在時還可以合成P(3HV)（聚3-羥基戊酸）或者P(3H2MB)（聚3-羥基2-甲基丁酸）。丁酸和戊酸可以分別通過丁酰輔酶A和戊酰輔酶A直接合成PHB 和PHV。糖類物質(zhì)可以通過糖酵解轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，進而合成PHA；乙酰輔酶A還可以進入脂肪酸合成途徑，最終轉(zhuǎn)化為羥酰輔酶A，從而合成PHA。長鏈脂肪酸通過β氧化進行解鏈，其中間產(chǎn)物酮酰輔酶A和烯酰輔酶A等都可以作為羥酰輔酶A的合成前體，最終合成PHA。

圖1 混菌合成PHA代謝途徑

3 合成工藝

使用乙酸等小分子脂肪酸（VFA）為底物時，一般采用兩段式工藝即PHA合成菌群的篩選富集以及PHA積累。有研究表明，使用糖基底物混菌優(yōu)先合成糖原而非PHA[9]，因此使用糖類等廢棄物時還需有一步底物酸化預處理，將復雜底物轉(zhuǎn)化為VFA，即三段式工藝。

3.1 厭氧酸化

厭氧酸化預處理步一般使用厭氧全混反應器（CSTR），該工藝結(jié)構(gòu)簡單，建造與運行成本低，耐沖擊負荷強，常作為廢水的預處理[10]。有機物的厭氧降解包括4個階段：水解、發(fā)酵酸化、產(chǎn)乙酸、產(chǎn)甲烷。該體系相當復雜，4個階段分別對應4種不同類型的細菌：水解細菌、發(fā)酵細菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細菌和產(chǎn)甲烷細菌。厭氧酸化步主要通過控制溫度、pH值、水力停留時間（HRT）等手段促進水解發(fā)酵過程，抑制產(chǎn)甲烷菌的生長，最終使產(chǎn)酸率達到最大。

3.2 PHA合成菌群篩選

PHA合成中菌群篩選是最重要的一步，目的是通過施加合理的壓力來獲得高產(chǎn)和穩(wěn)定的同質(zhì)菌群。前述兩種PHA合成機理衍生出了兩種主要的篩選策略：厭氧好氧模式篩選(AN/AE)和飽食饑餓模式篩選[FF，也稱動態(tài)底物投加方式（ADF）]。

3.2.1 AN/AE模式

AN/AE模式篩選得到的PAOs和GAOs合成的PHA含量最大可達到細胞干重的20%，但PHA產(chǎn)量不穩(wěn)定。Satoh等[11]在此基礎(chǔ)上進行了改進，提出微好氧工藝。通過在厭氧階段通入微量的氧氣既緩解了完全厭氧時聚磷或糖原水解產(chǎn)能有限，也避免了供氧充足時菌體主要進行同化作用而不積累PHA，從而篩選出高產(chǎn)PHA的優(yōu)良菌株。通過該工藝Satoh獲得PHA最高含量可達污泥干重的62%。鄭裕東等[12]對比了厭氧好氧和微氧好氧兩種工藝合成PHA的差別，染色和顯微照相的結(jié)果表明，微氧-好氧工藝中PHA在細胞中的含量明顯提高，但是該工藝的PHA產(chǎn)量也不穩(wěn)定。

3.2.2 ADF模式

ADF模式一般使用SBR反應器，因為SBR以間歇操作為主要特征，可以使微生物不斷經(jīng)歷營養(yǎng)豐富和匱乏階段。這種工藝積累PHA的能力強并且產(chǎn)量穩(wěn)定，是目前研究最為熱門、最有前景的技術(shù)。在以乙酸等簡單小分子有機酸為底物時，積累的PHA最高含量甚至可以達到純菌發(fā)酵的水平。但是當使用一些低值廢物質(zhì)時，PHA的積累水平較純種發(fā)酵還低得多。

不同篩選條件下，SBR中的微生物有很大的不同。Jiang 等[1]就發(fā)現(xiàn)20℃時污泥中主要菌群是Zoogloea，而30℃ 時Plasticicumulans acidivorans占據(jù)優(yōu)勢。其在另一篇文章中報道乙酸為底物時P. acidivorans是主要菌株，丙酸為底物時Thauera selenatis成為主要菌株，而當使用乙酸和丙酸混合物時，P. acidivorans和Thauerasp. 共存[13]。如何改進篩選工藝，優(yōu)化篩選條件，針對所使用的底物快速有效地獲得PHA高產(chǎn)菌群，將成為今后研究的主要方向和面對的主要挑戰(zhàn)。

3.3 PHA積累

PHA積累即利用酸化產(chǎn)的VFA和篩選得到的菌群進行PHA合成。PHA的產(chǎn)量和組成受底物、氮磷、pH值、溶氧（DO）、溫度等多因素影響。表1列出了一些使用不同底物與工藝生產(chǎn)PHA的例子。

3.3.1 底物影響

乙酸和丁酸等偶數(shù)碳原子VFA主要合成PHB，丙酸、戊酸等奇數(shù)碳原子VFA以及乳酸、長鏈脂肪酸等主要合成PHV?？梢姷孜锝M成直接影響最終PHA結(jié)構(gòu)，通過改變底物組成和配比可以對PHA組成和性狀進行調(diào)控，從而達到人們所需性能。進料方式對 PHA合成也有很大影響。一般認為分批脈沖加入發(fā)酵底物可以克服底物抑制。Albuquerque等[14]則認為，這種投料方式會降低產(chǎn)率，因為每次投料時須停止操作，倒出上清液并流加新底物，這樣會造成反應變慢或停止，消耗部分PHA，這方面的研究還有待深入。

3.3.2 氮磷影響

PHA是微生物在營養(yǎng)供給不平衡的情況下合成的。碳源充足時，通過限制氮磷的供給造成細胞生長抑制，從而促進PHA積累是一個簡單可行的辦法，也是大多數(shù)PHA生產(chǎn)研究中常用的方法。

3.3.3 pH值影響

pH 值對PHA合成的影響主要是由于高濃度有機酸造成的ATP泄漏。發(fā)酵底物乙酸等VFA在低pH值時大部分是未解離的，容易進入高pH值的胞內(nèi)環(huán)境并解離，使胞內(nèi)pH值降低。細胞在消耗ATP的情況下，泵出質(zhì)子，來維持膜內(nèi)外的質(zhì)子濃度差和電勢差，該過程消耗了ATP從而不利于PHA生產(chǎn)。因此PHA適宜在中性偏堿的環(huán)境中積累。Villano等[15]認為pH值不但會影響PHA的產(chǎn)量，還會影響PHA的單體組成，pH值越高，聚合物單體中HV含量越高。此外，pH值還會影響污泥和酶的穩(wěn)定性。

3.3.4 DO影響

氧氣作為反應中重要的電子受體，對PHA產(chǎn)量有很大影響。合適的DO可以促進活性污泥中細菌吸收代謝底物產(chǎn)生更多的ATP，從而PHA的合成；但過高的DO濃度會促進污泥生長而抑制PHA的合成[29]。需結(jié)合反應器類型、體積以及污泥濃度進行工藝條件優(yōu)化，確定合適的DO，以期獲得最大PHAs產(chǎn)量。

3.3.5 溫度影響

溫度的短期長期改變會對體系產(chǎn)生不同的影響。短期的改變主要影響微生物的代謝動力學；長期改變會影響活性污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)[30]。不同的微生物的最適溫度不同，得到的PHA的產(chǎn)量和種類也各異，因此長期溫度改變的影響更為顯著。好氧/厭氧模式下，溫度主要影響PAOs和GAOs的競爭。Lopez-Vazquez等[31]就發(fā)現(xiàn)10℃時，PAOs是優(yōu)勢菌群，隨著溫度增加GAOs逐漸占優(yōu)勢。而飽食饑餓模式下，Johnson等[32]研究表明，溫度由15℃升高到30℃過程中，體系的飽食階段持續(xù)時間逐漸縮短，菌體生長逐漸被抑制，PHB含量不斷增加，由35%增加到最大的84%?？梢姕囟葘HAs合成的影響是多方面的，應該結(jié)合實際反應工藝、pH值等其他條件，選取合適的發(fā)酵溫度。

4 提 取

將PHA從細胞中提取出來是其工業(yè)化生產(chǎn)的主要限制因素之一，提取成本很大程度上影響最終的PHA成本，因此提取方法的選擇意義重大。提取前一般有一步預處理來弱化堅固的細胞壁和細胞被膜，從而使后續(xù)的提取更加容易有效。預處理方法主要有加熱法、堿法、氯化鈉法和凍融循環(huán)法等[33]。加熱法和堿法主要通過變性蛋白質(zhì)等降低細胞的穩(wěn)定性，使用范圍廣；氯化鈉法和凍融循環(huán)法由于成本等因素不適宜工業(yè)上的大規(guī)模使用。提取法有溶劑抽提、次氯酸鈉法等傳統(tǒng)方法以及超臨界流以及新近的非PHA細胞質(zhì)子破碎等環(huán)境友好的方法。表2列出了一些主要的提取方法以及各自的原理和特點。

雖然混菌合成PHA仍處于試驗研究階段（其中混菌使用糖蜜生產(chǎn)PHA已實現(xiàn)工業(yè)化[2]），上述手段主要用于提取純種培養(yǎng)合成的PHA，隨著研究的不斷深入，可以相信不遠的將來混菌合成PHA也可以達到工業(yè)化的水平，屆時，PHA提取也將成為主要的限制因素。幸運的是，和純培養(yǎng)一樣，混菌體系中的菌群也主要是G菌，從而基于純培養(yǎng)合成的PHA提方法也可以用于混菌體系。

5 新近研究動態(tài)

由于混菌體系本身的復雜性以及細菌間相互作用關(guān)系的不可預知性，關(guān)于混菌產(chǎn)PHA的研究一直集中在工藝優(yōu)化等表觀層面，主要通過改變相應條件考量對最終PHA產(chǎn)量和組成的影響。隨著研究的不斷深入，模型構(gòu)建、代謝通量分析（MFA）和通量平衡分析（FBA）等純菌研究方法逐漸應用到混菌合成PHA的研究中，此外，末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（T-RFLP），變性梯度凝膠電泳（DGGE），實時熒光定量PCR（qPCR），顯微放射自顯影-原位熒光雜交（MAR-FISH）等先進技術(shù)手段的不斷成熟也為研究混菌合成PHA提供了強大的技術(shù)保障。近幾年混菌合成PHA的研究逐漸轉(zhuǎn)向了機理層面，從而更好的指導PHA合成菌群的篩選以及生產(chǎn)。

Johnson等[34]通過參數(shù)測定、修正、計算、平衡、評估五步法構(gòu)建了混菌合成PHA的基本模型。Jiang等[35]以乙酸和丙酸為底物構(gòu)建了PHA合成模型，該模型可以很好的預測底物對最終PHA組分的影響。Pardelha等[36]嘗試使用代謝通量分析（MFA）和通量平衡分析（FBA）來分析VFA組成和富集時間對最終PHA的影響。MFA分析表明，PHA儲藏通量與偶數(shù)碳原子VFA吸收通量有關(guān)，而HV通量與奇數(shù)碳原子VFA吸收通量有關(guān)；FBA分析顯示飽食饑餓模式馴化的結(jié)果是使TCA循環(huán)通量最小化，從而最大合成PHA。該研究表明PHA的組成和產(chǎn)量可以被很好的預測。與單菌不同，混菌是有多種微生物組成的復雜體系，而FBA只能對混合菌群整體進行分析，接著Pardelha又對FBA進行了改進，使用隔離FBA的分析方法來評估混菌體系細菌的代謝異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)PHA組成與VFA流加方式和菌落組成也有很大的關(guān)系[37]。此外，南開大學使用T-RFLP結(jié)合DGGE技術(shù)進行了菌群結(jié)構(gòu)分析并構(gòu)建了體系中PHA合成酶基因文庫，從基因角度對PHA組成進行了解釋[38]。

6 結(jié) 語

相對于單菌，混菌合成PHA具有很多優(yōu)勢，相關(guān)研究已經(jīng)取得了很大的進展，使用乙酸等小分子VFA為底物時混菌合成PHA的能力已經(jīng)可以與單菌媲美。但是混菌體系濃度低，報道的最大菌體濃度為7g/L，而純菌生產(chǎn)PHA其濃度一般能達到80g/L以上。此外，產(chǎn)量低也會加重提取負擔，最終增加PHA成本。Dias等[2]通過模型預測當混菌濃度達到10g/L以上時才可以與單純競爭。如何提高混菌濃度仍是混菌生產(chǎn)PHA面臨的主要挑戰(zhàn)，將是今后一段時間內(nèi)主要的研究方向。

常用的三段式工藝較為繁瑣，底物轉(zhuǎn)化率較低，廢水中已有的大量揮發(fā)性脂肪酸會對厭氧酸化造成強烈的抑制[39]。加之馴化周期長，有的研究使用的活性污泥混合菌群馴化時間長達2年[27]，極大制約了混菌生產(chǎn)PHA工業(yè)化進程。此外當以真實廢棄物為底物時，PHA的產(chǎn)量還很低，目前這方面的研究還處于起步階段，只有糖蜜產(chǎn)PHA實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)[2]。目前全世界范圍內(nèi)面臨資源短缺和環(huán)境污染問題，利用纖維素基原料合成PHA的研究將占據(jù)越來越重要的地位，基于此我們以木糖為底物，采用馴化篩選相結(jié)合的方法一步合成PHA，最終PHA積累占細胞干重的20%，取得了很好的效果。選擇合適的篩選壓力，簡化甚至創(chuàng)新生產(chǎn)工藝也將成為未來的研究熱點。

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Recent Advances in polyhydroxyalkanoates production by mixed cultures

LIU Yingjie1，JIA Xiaoqiang1,2,3，WEN Jianping1,2,3，BAN Rui1
（1Department of Biological Engineering，School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2Key Laboratory of Systems Bioengineering (Ministry of Education)，Tianjin University，Tianjin 300072，China；3SynBio Research Platform，Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering (Tianjin)，School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Polyhydroxyalkanoates (PHA) are biodegradable plastics synthesized by microorganism，which can be used as a substitute of chemical plastics. Synthesizing PHA by pure cultures is expensive due to the use of glucose and other high-quality substrates and the requirement of sterilization for the process，seriously restricting the widespread use of PHA; while synthetizing PHA by mixed cultures can use waste as substrate thus significantly reducing cost. The purpose of this paper is to describe the research advances in PHA production by mixed cultures，such as its history，synthesis mechanism，production process，and extraction method. The development of PHA production by mixed cultures is reviewed; two main synthesis mechanisms are described; metabolic pathways of different substrates to synthesize PHA are introduced; a three-stage synthesis process and product extraction are addressed; and recent research trends are summarized. Future research in this area should be focused on increasing concentration of mixed cultures and capacity of using real waste.

PHA；biodegradability；mixed cultures；biotechnology；polymers；synthesis

Q 819

A

1000-6613（2014）10-2729-07

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.10.034

2014-02-17；修改稿日期：2014-02-24。

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2014CB745100）、天津市應用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃青年項目（14JCQNJC06700）及天津大學自主創(chuàng)新基金項目。

劉英杰（1987—），男，碩士研究生。聯(lián)系人：賈曉強，副教授，碩士生導師。E-mail xqjia@tju.edu.cn。