低氧誘導(dǎo)因子-2α基因沉默對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株MG-63生物學(xué)行為的影響

朱 波 林珊珊 崔春萍 謝明均△

低氧誘導(dǎo)因子-2α基因沉默對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株MG-63生物學(xué)行為的影響

朱 波1林珊珊2崔春萍3謝明均1△

目的 探討低氧誘導(dǎo)因子-2α（HIF-2α）基因沉默對(duì)低氧狀態(tài)下骨肉瘤MG-63細(xì)胞的影響。方法Western Blot檢測MG-63細(xì)胞HIF-2α表達(dá)。利用小干擾RNA（siRNA）獲得MG-63/siHIF-2α（siHIF-2α）細(xì)胞，陰性對(duì)照為MG-63/scramble(NC)細(xì)胞。Western Blot檢測MG-63、NC和siHIF-2α細(xì)胞中HIF-2α、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、p-Erk/Erk及Mcl-1的表達(dá)。低氧下培養(yǎng)NC和siHIF-2α細(xì)胞，MTS試劑檢測細(xì)胞活性，劃痕遷移試驗(yàn)檢測遷移能力，克隆集落形成試驗(yàn)檢測集落形成率，裸鼠皮下移植瘤試驗(yàn)檢測體內(nèi)腫瘤生長情況。結(jié)果低氧可誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞的HIF-2α蛋白表達(dá)，并呈時(shí)間依賴性(F=2 037.412，P＜0.001)。低氧下siHIF-2α細(xì)胞的HIF-2α表達(dá)低于NC細(xì)胞（P＜0.01）。低氧12 h和24 h，siHIF-2α組細(xì)胞活性均低于NC組，相對(duì)劃痕寬度均大于NC組（P＜0.05或P＜0.01）。1 000～5 000細(xì)胞種植數(shù)的siHIF-2α組的集落形成率均小于NC組(P＜0.05或P＜0.01)。低氧下siHIF-2α細(xì)胞的VEGF、p-Erk/Erk和Mcl-1表達(dá)均低于NC細(xì)胞（P＜0.01）。裸鼠皮下移植瘤siHIF-2α組腫瘤體積、質(zhì)量和密度均小于NC組(P＜0.01)。結(jié)論阻斷HIF-2α信號(hào)通路可作為骨肉瘤臨床治療的新策略。

骨肉瘤；細(xì)胞系，腫瘤；RNA，小分子干擾；基因沉默；腫瘤移植；小鼠，近交BALB C；低氧誘導(dǎo)因子-2α

骨肉瘤是原發(fā)性骨惡性腫瘤中常見的實(shí)體腫瘤，惡性程度高，生長速度快，易引發(fā)內(nèi)部低氧微環(huán)境，導(dǎo)致低氧誘導(dǎo)因子（HIF）富集。HIF可促進(jìn)腫瘤血管生成[1]、能量代謝[2]、細(xì)胞生長、侵襲轉(zhuǎn)移和化療耐藥等過程[3]。但目前有關(guān)HIF-2α對(duì)腫瘤作用的研究尚少見相關(guān)報(bào)道[4]。有研究認(rèn)為HIF-2α參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程[5]，但其在骨肉瘤中的作用研究甚少。本研究旨在通過小干擾RNA（siRNA）基因沉默技術(shù)觀察HIF-2α基因沉默對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系MG-63增殖、遷移、侵襲等作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 改良杜氏伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基、胰酶及聚凝胺購自Sigma公司；胎牛血清（杭州四季青公司）；MTS溶液（Promega公司）；兔抗人HIF-2α抗體、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）多克隆抗體、兔抗人胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Erk）抗體、兔抗人磷酸化Erk（p-Erk）抗體、鼠抗人髓細(xì)胞白血病蛋白（Mcl-1）抗體（CST公司）；鼠抗人GAPDH抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（北京博奧森公司）；RIPA蛋白裂解液及聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白定量試劑盒購自Thermo公司；人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63購自中科院上海細(xì)胞庫。12只體質(zhì)量25 g左右，4周齡Balb/C雄性小鼠購自北京維通利華公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選用人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63和siRNA轉(zhuǎn)染后獲得的MG-63/siHIF-2α（siHIF-2α）和MG-63/scramble （NC）細(xì)胞，培養(yǎng)于10％胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5％CO2及飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。1％O2,5％CO2,以及94％N2的低氧培養(yǎng)箱（Thermo公司）模擬腫瘤內(nèi)部低氧微環(huán)境。

1.2.2 Western BlotMG-63細(xì)胞低氧培養(yǎng)0 h、6 h、12 h、24 h；MG-63、NC和siHIF-2α細(xì)胞低氧培養(yǎng)24 h。以RIPA裂解細(xì)胞，提取蛋白。蛋白加入5×Loading buffer配制成20 μL，100℃水浴10 min，12 000 r/min離心30 s后以12％的聚丙烯胺分離轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5％脫脂牛奶常溫封閉2 h，一抗4℃震蕩過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗常溫孵育1 h，最后加發(fā)光底物于暗室中用膠片曝光。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染 針對(duì)人HIF-2α的小干擾RNA用于沉默MG-63細(xì)胞的HIF-2α，序列為：上游5′-CAACCTGCAGCCTCAGTGTATC-3′，下游5′-CACCACGTCGTTCTTCTCGAT-3′；小干擾RNA scramble siRNA作為陰性對(duì)照，序列為：上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。根據(jù)磷酸鈣轉(zhuǎn)染法[6]獲得siRNA病毒。細(xì)胞培養(yǎng)基中先加入5 mg/L聚凝胺，再加入10倍于細(xì)胞數(shù)的siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒混勻，培養(yǎng)8 h后換液。獲得MG-63/ siHIF-2α（siHIF-2α）和MG-63/scramble（NC）細(xì)胞。72 h后，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 細(xì)胞活性MTS法檢測 MG-63細(xì)胞接種于96孔板，于低氧處理12 h、24 h時(shí)分別加入MTS 20 μL/孔，孵育1.5～2 h，酶標(biāo)儀（BioTek公司）于波長490 nm處測定光密度（OD）值。細(xì)胞活性（％）=(siHIF-2α組OD值/NC組OD值)×100％。

1.2.5 劃痕遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種于6孔板，生長密度達(dá)90％時(shí)，以20 μL槍頭尖在孔底輕劃痕，于0 h、12 h、24 h觀察劃痕愈合情況，以Image Processing and analysis in Java（Image J）2X軟件測量劃痕寬度。相對(duì)劃痕寬度=觀察點(diǎn)劃痕寬度/原始劃痕寬度。

1.2.6 集落形成試驗(yàn) NC和siHIF-2α細(xì)胞數(shù)分別以1×103、2×103、3×103、4×103、5×103的數(shù)量種入6孔板，低氧培養(yǎng)，每3 d換液1次。3周后，4％甲醛固定，結(jié)晶紫染色，×20倍顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.2.7 裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn) 12只Balb/C雄性小鼠隨機(jī)分為2組。收集siHIF-2α和NC細(xì)胞約1×107個(gè)，調(diào)整為0.3 mL細(xì)胞懸液接種于裸鼠背部皮下，4周后處死裸鼠，稱取腫瘤質(zhì)量（g），并計(jì)算腫瘤體積（cm3）。腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較選用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧對(duì)MG-63細(xì)胞HIF-2α表達(dá)的影響 0、6、 12及24 h的HIF-2α表達(dá)水平分別為57.74±5.43、1 073.26±35.11、1 675.63±38.97、1 821.88±31.63（F= 2 037.412，P＜0.001），0 h與6 h相比，6 h與12 h相比，12 h與24 h相比，HIF-2α表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。隨著低氧時(shí)間延長，HIF-2α蛋白表達(dá)量增加，見圖1。

Fig.1 Comparison of the HIF-2α expression level in MG-63 cells under hypoxia圖1 MG-63細(xì)胞HIF-2α表達(dá)水平的比較

2.2 siRNA病毒對(duì)HIF-2α基因的沉默效率 siRNA病毒轉(zhuǎn)染后，NC和siHIF-2α組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，熒光表達(dá)量尚可，見圖2。MG-63組、NC組和si-HIF-2α組的HIF-2α表達(dá)水平分別為3 083.26± 116.35、2 920.61±65.33及752.22±29.01（F=817.462，P＜0.001），其中MG-63組和NC組HIF-2α表達(dá)水平差異不明顯（P=0.321），NC組表達(dá)水平高于siHIF-2α組（P＜0.001），siHIF-2α組的HIF-2α蛋白表達(dá)受抑制，見圖3。

Fig.2 Representative images of MG-63 cells transfected by lentivirus with siHIF-2α(siHIF-2α)or scramble(NC)siRNA（×400）圖2 NC組和siHIF-2α組細(xì)胞的鏡下圖及熒光圖（×400）

Fig.3 HIF-2α protein expression in MG-63,NC and siHIF-2α cells under hypoxia condition圖3 HIF-2α基因沉默對(duì)HIF-2α表達(dá)的影響

2.3 HIF-2α基因沉默對(duì)低氧環(huán)境MG-63細(xì)胞的影響 NC組12 h和24 h時(shí)細(xì)胞活性均高于siHIF-2α組，而相對(duì)劃痕寬度均低于siHIF-2α組（P＜0.05或P＜0.01），見表1。NC組于不同種植細(xì)胞數(shù)下的克隆集落形成率均高于siHIF-2α組（P＜0.05或P＜0.01），見表2。低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，MG-63組和NC組的VEGF、p-Erk/Erk和Mcl-1表達(dá)水平差異不明顯（均P＞0.05），而NC組的VEGF、p-Erk/Erk和Mcl-1表達(dá)水平均高于siHIF-2α組（均P＜0.001），見表3、圖4。

Tab.1 Comparation of cell viability and relative scratch width of NC and siHIF-2α cells表1 NC組和siHIF-2α組細(xì)胞活性及相對(duì)劃痕寬度比較 （n=3，±s）

Tab.1 Comparation of cell viability and relative scratch width of NC and siHIF-2α cells表1 NC組和siHIF-2α組細(xì)胞活性及相對(duì)劃痕寬度比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別NC組siHIF-2α組t細(xì)胞活性(％) 12 h 100.00±4.91 77.72±7.15 4.449＊24 h 100.00±3.33 72.33±2.99 10.710＊＊相對(duì)劃痕寬度12 h 0.78±0.03 0.95±0.02 8.167＊＊24 h 0.21±0.01 0.78±0.02 44.150＊＊

Tab.2 Comparation of clone formation rate(％)of NC and siHIF-2α cells at different cell counts表2 NC組和siHIF-2α組在不同種植細(xì)胞數(shù)下克隆集落形成率比較 （n=3，％，±s）

Tab.2 Comparation of clone formation rate(％)of NC and siHIF-2α cells at different cell counts表2 NC組和siHIF-2α組在不同種植細(xì)胞數(shù)下克隆集落形成率比較 （n=3，％，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別NC組siHIF-2α組t 1 000 2.57±0.25 1.02±0.15 9.208＊＊2 000 2.75±0.18 1.17±0.27 8.433＊＊3 000 2.76±0.28 1.35±0.22 6.858＊＊4 000 2.93±0.39 1.44±0.19 5.949＊5 000 3.91±0.40 1.98±0.27 6.927＊＊

Tab.3 Comparation of VEGF,p-Erk/Erk and Mcl-1 expression in MG-63,NC and siHIF-2α cells表3 MG-63組、NC組和siHIF-2α組的VEGF、p-Erk/Erk及Mcl-1表達(dá)比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparation of VEGF,p-Erk/Erk and Mcl-1 expression in MG-63,NC and siHIF-2α cells表3 MG-63組、NC組和siHIF-2α組的VEGF、p-Erk/Erk及Mcl-1表達(dá)比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，P＜0.001

組別MG-63組NC組siHIF-2α組F VEGF 2 728.08±276.22 2 722.53±259.78 593.29±113.05a87.098＊＊p-Erk/Erk 2 681.69±75.75 2 457.01±341.58 1 013.80±56.95a58.672＊＊Mcl-1 1 374.16±21.82 1 382.75±32.62 592.14±12.23a1 280.843＊＊

Fig.4 VEGF,p-Erk/Erk and Mcl-1 protein expressions were determined by Weatern blot under hypoxia condition圖4 VEGF、p-Erk/Erk及Mcl-1蛋白表達(dá)的Western Blot檢測結(jié)果

2.4HIF-2α基因沉默對(duì)裸鼠皮下移植瘤的影響 siHIF-2α組瘤體體積、質(zhì)量和密度均小于NC組，見表4、圖5。

Tab.4 Comparation of size,weight and density of NC and siHIF-2α xenograft tumors表4 NC組和siHIF-2α組皮下移植瘤體積、質(zhì)量和密度比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparation of size,weight and density of NC and siHIF-2α xenograft tumors表4 NC組和siHIF-2α組皮下移植瘤體積、質(zhì)量和密度比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01

組別NC組siHIF-2α組t成瘤率6/6 6/6-體積（cm3）0.486±0.108 0.196±0.071 3.886＊＊質(zhì)量（g）0.384±0.108 0.049±0.009 5.354＊＊密度（g/cm3）0.790±1.002 0.251±0.001 417.5＊＊

Fig.5 Images of xenograft tumors圖5 裸鼠皮下移植瘤

3 討論

骨肉瘤侵襲能力較強(qiáng)，容易轉(zhuǎn)移到肺等重要器官，預(yù)后較差。發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者5年生存率較低[7]。通常情況下，腫瘤內(nèi)部的低氧微環(huán)境會(huì)促使腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為向惡性方向轉(zhuǎn)化。HIF是低氧環(huán)境中基因轉(zhuǎn)錄、信息傳遞的重要途徑[8]。在骨肉瘤中，HIF-2α早于HIF-1α激活下游靶基因[9]。

本研究顯示，隨著低氧時(shí)間延長，HIF-2α蛋白表達(dá)量呈增加趨勢，證實(shí)HIF-2α蛋白表達(dá)與低氧具有一定的時(shí)間依賴性，表明低氧條件下能夠成功地誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞中HIF-2α的表達(dá)。小RNA干擾技術(shù)以下調(diào)HIF-2α表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MG-63組和NC組HIF-2α表達(dá)水平差異不明顯，NC組表達(dá)水平高于siHIF-2α組，表明HIF-2α基因沉默效果良好。MTS檢測結(jié)果和劃痕遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在低氧12 h和24 h時(shí)，NC組的細(xì)胞活性均高于siHIF-2α組，而相對(duì)劃痕寬度均低于siHIF-2α組，表明HIF-2α基因沉默可顯著地抑制MG-63細(xì)胞在低氧環(huán)境下的細(xì)胞存活和遷移能力?？寺〖湫纬稍囼?yàn)結(jié)果顯示，各個(gè)種植細(xì)胞數(shù)的siHIF-2α細(xì)胞的克隆集落形成率均小于NC細(xì)胞，表明HIF-2α基因沉默顯著地抑制骨肉瘤細(xì)胞在低氧狀態(tài)下的增殖能力。這提示HIF-2α很可能是骨肉瘤腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧微環(huán)境，并發(fā)生生物學(xué)行為惡化的關(guān)鍵因子，與相關(guān)研究結(jié)果一致[10]。Ben-Shoshan等[11]研究亦認(rèn)為，HIF-2α可作用于c-Myc下游靶基因，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程和低氧狀態(tài)下的細(xì)胞增殖。

VEGF為目前已知的作用最強(qiáng)的血管生成因子之一，是廣泛轉(zhuǎn)移性惡性疾病的重要原因[11]。Erk通路可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活[12]，Mcl-1蛋白是Bcl-2家族的成員，具有抗凋亡的作用[13]。本研究顯示，si-HIF-2α組較NC組VEGF、p-Erk/Erk和Mcl-1表達(dá)水平均降低，表明HIF-2α基因沉默可通過下調(diào)VEGF而抑制骨肉瘤血管形成，也可抑制Erk磷酸化而抑制骨肉瘤細(xì)胞存活，還可抑制Mcl-1促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示，siHIF-2α組瘤體的體積、質(zhì)量和密度均小于NC組，提示HIF-2α基因沉默很可能極大地抑制了腫瘤細(xì)胞內(nèi)各種蛋白的合成分泌，或者抑制了腫瘤瘤體內(nèi)毛細(xì)血管的生成，從而導(dǎo)致瘤體內(nèi)血漿蛋白的減少。進(jìn)一步證實(shí)HIF-2α基因沉默打破了骨肉瘤細(xì)胞對(duì)低氧微環(huán)境的適應(yīng)能力，對(duì)骨肉瘤的生長具有顯著的抑制作用。

綜上所述，低氧環(huán)境可誘導(dǎo)HIF-2α的表達(dá)，HIF-2α可能是骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，而阻斷HIF-2α信號(hào)通路有可能成為臨床治療骨肉瘤的另一重要手段和策略。

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（2013-11-25收稿 2014-02-20修回）

（本文編輯 陸榮展）

Effect of Hypoxia-Inducible Factor（HIF）-2 Alpha Silencing on Osteosarcoma MG-63 Cells

ZHU Bo1,LIN Shanshan2,CUI Chunping3,XIE Mingjun1
1 Department of General Surgery，2 Department of Rehabilitation,the First People’s Hospital of Yibin, Sichuan 644000,China;3 Radiation Medicine and Radiation of Military Medical College Institute XIE Mingjun,E-mail：527121032@qq.com

ObjectiveTo investigate the effect of HIF-2a silencing by transfection of siRNA into MG-63 cells under hypoxia.MethodsHIF-2α expression level in MG-63 cells under hypoxia was determined by Western Blot.Small interfering RNA(siRNA)was used to construct MG-63/siHIF-2α（siHIF-2α）cells and control MG-63/scramble(NC)cells. The expression levels of HIF-2α,Vascular endothelial growth factor(VEGF),p-Erk/ErK and Mcl-1 in MG-63,NC and si-HIF-2α cells was determined by Western Blot.NC and siHIF-2α cells were cultured under hypoxia.Cell viability was assessed by MTT assay.Migration was identified by scratch migration assay.Tumor formation was identified by clone formation assay.Nude mouse subcutaneous xenograft model was used to investigate tumor development in vivo.ResultsHypoxia improved HIF-2α expression in MG-63 cells in a time-dependent manner(F=2 037.412，P＜0.001).HIF-2α expression under hypoxia in siHIF-2αcells was lower than that in NC cells(P＜0.01).Cell viability of siHIF-2α cells under hypoxia for 12 h and 24 h were lower than that in NC cells(P＜0.05 or P＜0.01).The relative width of scratch in siHIF-2α group under hypoxia for 12 h and 24 h were larger than that in NC group(P＜0.01 or P＜0.01).When cell counts reach 1 000-5 000,the clone formation rates of siHIF-2α cells were lower than that in NC cells(P＜0.05 or P＜0.01).The expression of VEGF,p-Erk/Erk and Mcl-1 protein under hypoxia in siHIF-2α cells was lower than that in NC cells(P＜0.01).Tumor sizes,weights and density of siHIF-2α group in nude mice were suppressed compared with those in NC group(P＜0.01).ConclusionBlocking HIF-2α signal pathway warrants its investigation as a potential strategy in osteosarcoma treatment.

osteosarcoma；cell line,tumor;RNA,small interfering；gene silencing;neoplasm transplantation;mice, inbred BALB C;hypoxia-inducible factor 2 alpha

R738.1，R349.5

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.012

1宜賓市第一人民醫(yī)院普外科（郵編644000），2康復(fù)醫(yī)學(xué)科；3軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)與輻射研究所△

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