西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯(lián)物的制備及鑒定

劉云龍 周 潔 王光文 聶 振

細(xì)胞與分子生物學(xué)

西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯(lián)物的制備及鑒定

劉云龍 周 潔△王光文 聶 振

目的 制備西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯(lián)物并鑒定其酶活性與抗體活性。方法采用4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)將西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。采用非還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、比色法、間接免疫熒光法對偶聯(lián)物進(jìn)行鑒定并檢測β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗的活性。結(jié)果在電泳圖上可分別見到β葡萄糖苷酶、西妥昔單抗、西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯(lián)物的清晰條帶。比色法測定結(jié)果顯示，西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物的酶活性低于β-葡萄糖苷酶(U/L：672.97±46.19 vs 869.50±57.28，t=5.972，P＜0.05)，但仍保持良好的酶活性。在熒光顯微鏡下可見到與偶聯(lián)物共同作用的人膀胱癌EJ細(xì)胞帶有紅色熒光。結(jié)論Sulfo-SMCC可成功將西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)，且偶聯(lián)物仍能保持良好的酶活性與抗體活性。

西妥昔單抗；β-葡萄糖苷酶；偶聯(lián)物；膀胱腫瘤；癌；Sulfo-SMCC

化療是目前治療腫瘤的主要方法之一，提高化療藥物的治療效果，降低其不良反應(yīng)一直是研究熱點(diǎn)?？贵w介導(dǎo)的酶前體藥物療法(antibody directed enzyme prodrug therapy,ADEPT）是先將酶導(dǎo)向靶部位，再給予無抗癌活性或低活性的前體藥物，在酶的催化下將其轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性藥物，從而實(shí)現(xiàn)抗癌藥物在靶部位特異性釋放的一種方法，該療法不僅提高了藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率，而且很大程度上降低了化療藥物引起的不良反應(yīng)[1-2]。β-葡萄糖苷酶/苦杏仁苷酶解前藥療法是使用較多的ADEPT之一，苦杏仁苷本身毒性很低，經(jīng)β-葡萄糖苷酶激活后可以產(chǎn)生氫氰酸（HCN），抑制細(xì)胞呼吸，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。西妥昔單抗是一種新型的人-鼠單克隆嵌合抗表皮生長因子受體（EGFR）抗體，其能夠?qū)⒚笇?dǎo)向靶部位，實(shí)現(xiàn)藥物的特異性靶向殺傷作用，在EGFR陽性的惡性腫瘤中能發(fā)揮出色的抗腫瘤活性，顯著增強(qiáng)放療和化療的效果，目前主要應(yīng)用于結(jié)直腸癌和頭頸部鱗癌的治療，在膀胱癌方面的應(yīng)用還比較少[4]。本研究通過化學(xué)偶聯(lián)的方法制備西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯(lián)物并鑒定其酶活性與抗體活性，以期為進(jìn)一步研究其對膀胱癌的療效奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 西妥昔單抗購自德國Merck公司；4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)、Traut’s試劑購自美國Thermo Fisher公司；純化脫鹽柱購自美國Thermo公司；Amicon Ultra-15超濾離心管購自美國Millipore公司；人膀胱癌EJ細(xì)胞株購自南京凱基細(xì)胞公司；羅丹明標(biāo)記羊抗人IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；β-葡萄糖苷酶、對硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物的制備 取4 mg西妥昔單抗，采用含2 mmol/L EDTA的PBS（pH 8.0）稀釋其至2 g/L，然后加入Traut’s試劑74 μg，室溫?fù)u床反應(yīng)1 h，純化脫鹽、超濾除去過量的巰基化試劑及其他反應(yīng)雜質(zhì)，濃縮后即得到巰基化的西妥昔單抗1 mL。稱取β-葡萄糖苷酶9.2 mg，用1 mL PBS(pH 7.5，0.01 mol/L)溶解，加入10 mmol/L的異型雙功能偶聯(lián)劑衍生物Sulfo-SMCC溶液220 μL，室溫?fù)u床反應(yīng)1 h，采用同上方法除去過量的Sulfo-SMCC及雜質(zhì)，濃縮活化β-葡萄糖苷酶至4 mL。將上述制備的西妥昔單抗加入到活化好的β-葡萄糖苷酶溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，超濾除去過量的β-葡萄糖苷酶及其他反應(yīng)雜質(zhì)，濃縮后即得到西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物。

1.2.2 西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物的鑒定 （1）非還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定偶聯(lián)物。分別取適量西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶溶液、西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物使用上樣緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，進(jìn)行7％非還原型SDS-PAGE，以鑒定西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物的連接情況。（2）比色法鑒定西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物酶活性。將β-葡萄糖苷酶溶液、西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物分別用PBS調(diào)整為相同的濃度0.5 g/L，以β-葡萄糖苷酶溶液作為對照測定偶聯(lián)物的酶活性。取2支10 mL離心管分別加入4.9 mL底物液[用檸檬酸磷酸鹽緩沖液（pH 6.0，0.1 mol/L）將對硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷配成終濃度為5 mmol/L底物液]和0.1 mL β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物，37℃水浴反應(yīng)，5 min、15 min時(shí)分別取出0.5 mL反應(yīng)液，加入1 mL碳酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）終止反應(yīng)。從各管終止液反應(yīng)體系中取200 μL加入96孔板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，根據(jù)底物水解后釋放出來的對硝基苯酚在405 nm處的特征吸收峰，在酶標(biāo)儀下測定每孔吸光度（A405）值。參照文獻(xiàn)[5]計(jì)算酶活性（U/L）。（3）間接免疫熒光法檢測西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物。取對數(shù)生長期人膀胱癌EJ細(xì)胞接種于6孔板(1×106個(gè)/mL)，培養(yǎng)至貼壁，用PBS洗滌2遍，加入200 μL 2％BSA 37℃封閉60 min，PBS洗滌2遍，選擇其中3孔加入適當(dāng)稀釋后的西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物100 μL，剩余3孔加入PBS 100 μL作為陰性對照，4℃靜置60 min。PBS洗滌2遍，分別加入50 μL羅丹明標(biāo)記羊抗人IgG，4℃靜置30 min，PBS洗滌3遍后，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物的SDSPAGE結(jié)果 在1、2泳道可見到與β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗相對應(yīng)位置的條帶；3泳道高分子質(zhì)量端可見到清晰的條帶，而在西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶相對應(yīng)的位置未見條帶，表明西妥昔單抗與β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)成功，見圖1。

Fig.1 Cetuximab-β-glucosidase conjugate 7％non-reduced SDSPAGE results圖1 西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物7％非還原型SDSPAGE結(jié)果

2.2 西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物的酶活性測定結(jié)果 與相同濃度的β-葡萄糖苷酶相比，西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物酶活性有所下降(U/L：672.97±46.19 vs 869.50±57.28，t=5.972，P＜0.05)。

2.3 間接免疫熒光檢測結(jié)果 與西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物共同作用的人膀胱癌EJ細(xì)胞在熒光顯微鏡下可見到紅色熒光，而對照組無熒光，見圖2。

3 討論

隨著對蛋白交聯(lián)技術(shù)的研究，人們發(fā)展了一系列異型雙功能交聯(lián)試劑用于蛋白質(zhì)間的交聯(lián)，其中馬來酰亞胺基類活潑酯是應(yīng)用較為普遍的一種，包括（N-馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯（SMCC）、N-羥基琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)等。SMCC是對抗體進(jìn)行酶標(biāo)記的理想試劑，可較好地保持酶和抗體的活性，其交聯(lián)原理是首先將含有氨基的蛋白質(zhì)與幾倍劑量的偶聯(lián)劑反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過脫鹽、超濾等方法除去沒有反應(yīng)完的SMCC，再與含有巰基的蛋白質(zhì)反應(yīng)[6]。在探索抗體與酶偶聯(lián)的過程中，筆者首先采用了本課題組使用的偶聯(lián)劑SPDP，其偶聯(lián)原理較SMCC復(fù)雜，蛋白質(zhì)之間會產(chǎn)生一部分自身交聯(lián)產(chǎn)物，且其純化過程繁瑣，導(dǎo)致偶聯(lián)物產(chǎn)量低、純度低等不足[7]。采用SMCC進(jìn)行偶聯(lián)只需兩步反應(yīng)，在經(jīng)過脫鹽、超濾后即可得到純度高的偶聯(lián)產(chǎn)物，同時(shí)偶聯(lián)物保持了良好的活性。因此，SMCC是對抗體進(jìn)行酶標(biāo)記的理想試劑。而SMCC難溶于水，在進(jìn)行蛋白修飾前必須先將SMCC溶于有機(jī)溶劑如DMSO或DMF中，為避免加入有機(jī)溶劑對蛋白活性造成的影響，本實(shí)驗(yàn)采用了其磺化后的衍生物Sulfo-SMCC。

應(yīng)用Sulfo-SMCC偶聯(lián)后，本研究通過非還原型SDS-PAGE對產(chǎn)物進(jìn)行了初步鑒定，在3泳道高分子質(zhì)量端可見到清晰的條帶，而在西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶相對應(yīng)的位置未見條帶。用比色法測定后發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)物中β-葡萄糖苷酶的酶活性低于同等濃度β-葡萄糖苷酶活性。間接免疫熒光法測定結(jié)果示西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶在偶聯(lián)后抗體活性仍然存在。表明西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯(lián)物已成功制備，為進(jìn)一步研究其抗腫瘤效應(yīng)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

西妥昔單抗可與EGFR的內(nèi)源性配體競爭性地與EGFR胞外配體結(jié)合區(qū)相結(jié)合，阻斷EGFR二聚體的形成，從而抑制癌細(xì)胞的增殖和腫瘤生長[8]。 Bhuvaneswari等[9]將西妥昔單抗與光動(dòng)力療法（PDT）聯(lián)合應(yīng)用于膀胱腫瘤異種移植模型，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)PDT相比，聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著地抑制腫瘤的生長。EGFR是一種跨膜糖蛋白，在膀胱癌、頭頸部鱗癌、以及前列腺癌中有過量表達(dá)，為腫瘤治療提供了一個(gè)理想靶點(diǎn)[10]。此外，在膀胱癌靶向治療研究中，EGFR通路在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移和血管生成中也起到關(guān)鍵作用[11]。

Fig.2 Immunofluorescence images of cetuximab-β-glucosidase coupling product(×400)圖2 西妥昔單抗-β葡萄糖苷酶偶聯(lián)產(chǎn)物的免疫熒光檢測結(jié)果（×400）

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（2014-07-07收稿 2014-08-12修回）

（本文編輯 閆娟）

Preparation and Identification of Cetuximab-β-Glucosidase Conjugates

LIU Yunlong,ZHOU Jie△,WANG Guangwen,NIE Zhen
Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China△

E-mail：zhoujieuser@163.com

ObjectiveTo prepare cetuximab-β-glucosidase conjugates and to identify its enzymatic activity and antibody activity.MethodsCetuximab and β-glucosidase were crosslinked by Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC).Cetuximab-β-glucosidase conjugates and its enzymatic and antibody activity were examined by non-reduced SDS-PAGE,colorimetry and indirect immunofluorescence assay.ResultsWe can see clear bands of β-glucosidase,cetuximab,cetuximab-β-glucosidase conjugates through electropherogram.Although the enzymatic activity of cetuximab-β-glucosidase conjugates was lower than that of β-glucosidase(U/L：672.97±46.19 vs 869.50± 57.28，t=5.972，P＜0.05)shown by colorimetry assay,it still maintain good enzymatic activity.Under fluorescence microscope,we can see the conjugates interacted with human bladder cancer EJ cells are in a red fluorescence.ConclusionCetuximab,β-glucosidase were crosslinked successfully by Sulfo-SMCC without altered its enzymatic and antibody activity.

cetuximab;β-glucosidase;conjugates;urinary bladder neoplasms;carcinoma;Sulfo-SMCC

R737.1，R73-36

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81160314）

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科（郵編530021）

△通訊作者 E-mail：zhoujieuser@163.com