針對人SND1基因兩個AUG的細(xì)胞應(yīng)激分析

高星杰何津巖葛林張毅付雪尹潔張緯史雪彬蘇征姚智楊潔,△

細(xì)胞與分子生物學(xué)

針對人SND1基因兩個AUG的細(xì)胞應(yīng)激分析

高星杰1何津巖2葛林2張毅3付雪1尹潔1張緯2史雪彬2蘇征2姚智2楊潔1,2△

目的針對人SND1基因2個蛋白翻譯起始密碼子AUG構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/ 2，并分析2個AUG在SND1應(yīng)激顆粒形成中的作用。方法以SND1全長轉(zhuǎn)錄本為模板，PCR法擴(kuò)增含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的目的基因SND1-No1/2，雙酶切法分別酶切目的基因片段和線性pCMV-N-Flag，以T4-DNA連接酶將兩者連接成pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質(zhì)粒，然后將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞內(nèi)，以Western印跡法檢測Flag標(biāo)簽（DYKDDDDK）與SND1-No1/2的融合表達(dá)，最后以細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測在氧化應(yīng)激狀態(tài)下Flag-SND1-No1/2融合蛋白與內(nèi)源性SND1應(yīng)激顆粒的胞內(nèi)共定位情況。結(jié)果以單/雙酶切及基因測序法鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒無誤，Western印跡結(jié)果檢測到融合蛋白Flag-SND1-No1/2的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示Flag-SND1-No1/2均可與內(nèi)源性SND1應(yīng)激顆粒共定位。結(jié)論重組pCMV-N-Flag-SND1-No1/2質(zhì)粒構(gòu)建成功，SND1基因第1個AUG的缺失并不影響SND1應(yīng)激顆粒的形成。

重組融合蛋白質(zhì)類；應(yīng)激；質(zhì)粒；基因表達(dá)；SND1；AUG；應(yīng)激顆粒

人類SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）蛋白，又稱為p100或Tudor-SN（Tudor staphylococcal nuclease），參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞應(yīng)激、pre-mRNA剪切等多種生物學(xué)過程[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，多個物種的SND1基因序列中存在2個蛋白翻譯起始密碼子AUG[4-5]，而目前對于它的功能探討尚少見。本課題針對人類SND1基因的兩個AUG，分別構(gòu)建pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質(zhì)粒，在真核細(xì)胞內(nèi)融合表達(dá)N端攜帶Flag標(biāo)簽的SND1-No1蛋白（以第1個AUG為起始點(diǎn)）與SND1-No2蛋白（以第2個AUG為起始點(diǎn)），繼而進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞應(yīng)激角度分析兩個AUG在SND1應(yīng)激顆粒形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞及菌株pCMV-N-Flag載體購自碧云天公司；SND1全長轉(zhuǎn)錄本FL23924購自美國復(fù)能基因；HeLa細(xì)胞來自本實(shí)驗(yàn)室；Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑與儀器Taq酶購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠源IgG二抗購自Fermentas公司；T/A載體（pEASY-T1）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖匈徸员本┧鱽韺毧萍加邢薰?；DNA快速凝膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000、Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗羊IgG熒光二抗、Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗鼠IgG熒光二抗購自Invitrogen公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；BCA蛋白測定試劑盒購自Pierce公司；多克隆羊源抗SND1抗體、DAPI染料購自Santa公司；LumiGLo化學(xué)發(fā)光底物購于KPL公司；單克隆鼠源抗Flag抗體、單克隆鼠源抗β-actin一抗、亞砷酸鹽購自Sigma公司；激光共聚焦皿購自NEST公司；激光共聚焦熒光顯微鏡（基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心）購自日本Olympus公司；引物合成及基因測序工作由北京天一輝遠(yuǎn)公司完成。

1.2 方法

1.2.1 獲取目的基因片段首先根據(jù)SND1的蛋白編碼區(qū)序列（NM_014390.2）設(shè)計含有BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物序列，見表1。再以質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖刑崛“琒ND1全長轉(zhuǎn)錄本的FL23924質(zhì)粒，并以其為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃30 s，60℃50 s，72℃3 min，進(jìn)行35個循環(huán)，72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段回收，在T4 DNA連接酶作用下，與pEASY-T1（T/A載體）25℃連接15 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐/卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴(kuò)增并提取質(zhì)粒。以BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，凝膠回收試劑盒回收并純化各目的片段。

Tab.1 The primer sequences of SND1-NO1/2 gene fragment表1 SND1-No1/2基因片段引物序列

1.2.2 線性pCMV-N-Flag的獲取以質(zhì)粒快速小提試劑盒提取pCMV-N-Flag質(zhì)粒，進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，完整切下線性pCMV-N-Flag質(zhì)粒載體，0.75％瓊脂糖電泳分離。凝膠回收試劑盒回收得到4 321 bp的線性pCMV-NFlag。

1.2.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/2的構(gòu)建在T4 DNA連接酶作用下，將線性pCMV-N-Flag質(zhì)粒載體與具有相同黏性末端的SND1-No1/2功能片段進(jìn)行22℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴(kuò)增并提取重組質(zhì)粒。

1.2.4 酶切及基因測序鑒定用BamHⅠ和EcoRⅠ對重組質(zhì)粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/2進(jìn)行單、雙酶切，并以0.75％的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證片段的大小。同時，對重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測序鑒定。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及Western印跡檢測以去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取無內(nèi)毒素pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質(zhì)粒。HeLa細(xì)胞接種至激光共聚焦皿中，置于含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞80％匯合時，依據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。分別轉(zhuǎn)染pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質(zhì)粒以及pCMV-N-Flag空載對照質(zhì)粒后48 h，先以預(yù)冷的1×PBS溶液洗滌轉(zhuǎn)染后HeLa細(xì)胞3次，加入預(yù)冷的1×NP-40裂解液裂解細(xì)胞，晃動培養(yǎng)板數(shù)次以確保裂解液完全覆蓋細(xì)胞，用無菌的細(xì)胞刮刮取細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至一個1.5 mL Eppendorf管中，冰浴20 min。超聲破碎細(xì)胞后4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清獲得全細(xì)胞裂解液，以BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。裂解液中加入SDS上樣緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl pH6.8，2％SDS，0.1％溴酚藍(lán)，10％甘油，2.5％β-巰基乙醇），99℃熱變性5 min，進(jìn)行6％SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，以半干轉(zhuǎn)法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5％脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，分別加入單克隆鼠源抗Flag一抗，單克隆鼠源抗β-actin一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠源IgG二抗（1∶15 000）室溫孵育1 h，TBST溶液再次洗膜3次，每次10 min。加入LumiGLo化學(xué)發(fā)光底物后暗室曝光。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質(zhì)粒后48 h，分為正常組與應(yīng)激組（0.5 mmol/L亞砷酸鹽，1 h）。4％多聚甲醛室溫固定10 min，加500 μL 1 g/L DAPI室溫避光孵育3 min，PBS洗滌3次，5 min/次；0.2％通透液（含0.2％Triton X-100的PBS）室溫靜置通透10 min；再加入1％ BSA封閉1 h。加入多克隆羊源抗SND1一抗和單抗體鼠源抗Flag一抗的混合液（1∶100）4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，10 min/次。再加入Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗羊IgG熒光二抗與Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗鼠IgG熒光二抗的混合液（1∶800），4℃孵育8 h。PBS洗滌3次，10 min/次。最后以激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光信號。每組實(shí)驗(yàn)檢測50個細(xì)胞，分別重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增目的片段以SND1全長轉(zhuǎn)錄本為模板，針對2個AUG進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以0.75％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，結(jié)果在2 700 bp左右觀察到與目的片段長度相符的熒光條帶，其中SND1-No2條帶位置比SND1-No1略低，見圖1。

Fig.1 The obtaining of targeting SND1-No1/2 fragment圖1 目的片段SND1-No1/2的獲取

2.2 線性pCMV-N-Flag質(zhì)粒載體的獲取采用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCMV-N-Flag質(zhì)粒，切下完整的線性pCMV-N-Flag質(zhì)粒載體，見圖2。經(jīng)0.75％的瓊脂糖凝膠電泳，可在4 300 bp左右出現(xiàn)條帶，見圖3。純化回收后用于后續(xù)的連接反應(yīng)。

Fig.2 The map of pCMV-N-Flag vector圖2 pCMV-N-Flag載體圖譜

2.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/ 2的鑒定將重組質(zhì)粒分別進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ的單、雙酶切，經(jīng)0.75％的瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)生的條帶大小與預(yù)期相符，見圖4，重組質(zhì)?；驕y序結(jié)果也正確。

Fig.3 The obtaining of linear pCMV-N-Flag vector圖3 線性pCMV-N-Flag質(zhì)粒載體的獲取

Fig.4 Single/double enzyme digestion of pCMV-N-Flag-SND1-No1/2圖4 pCMV-N-Flag-SND1-No1/2的單、雙酶切鑒定圖

2.4Western印跡法檢測融合蛋白表達(dá)收集轉(zhuǎn)染有pCMV-N-Flag-SND1-No1/2和pCMV-N-Flag空載（vector）的HeLa細(xì)胞，分別以鼠源抗Flag抗體檢測融合蛋白Flag-SND1-No1/2的表達(dá)，以抗β-actin抗體檢測內(nèi)源性β-actin的表達(dá)。其中Flag-SND1-No1/2蛋白分子質(zhì)量分別為102.0 ku，99.7 ku。Western印跡法檢測出與目的融合蛋白分子質(zhì)量相符的蛋白條帶，見圖5。

Fig.5 The data of Western blotting assay圖5 Western印跡結(jié)果

2.5 熒光共定位分析見圖6。將pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞，以抗Flag抗體和抗SND1抗體進(jìn)行免疫熒光分析，激光共聚焦熒光顯微鏡下可見正常組中Flag-SND1-No1/2主要分布于細(xì)胞漿中；當(dāng)給予0.5 mmol/L亞砷酸鹽氧化應(yīng)激處理時，兩者均可呈顆粒狀分布，且與內(nèi)源性的SND1應(yīng)激顆粒呈共定位關(guān)系。

Fig.6 Cellular co-localization analysis of Flag-tagged SND1-No1/2 and endogenous SND1 protein圖6 Flag-SND1-No1/2與內(nèi)源性SND1的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激共定位分析

3 討論

多功能SND1蛋白首次是作為EB病毒細(xì)胞核抗原2（Epstein-Barr virus nuclear protein 2，EBNA2）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活因子被發(fā)現(xiàn)的[4]，與過敏[1]、乳腺癌[6]、肝癌[7]等多種臨床疾病密切相關(guān)。研究證實(shí)，人類SND1蛋白（NP_055205.2）由N端4個重復(fù)葡萄球菌核酸酶樣（Staphylococcal nucleases-like，SN-like）的SN（1～4）結(jié)構(gòu)域及C端的SN5a-Tudor-SN5b（TSN）結(jié)構(gòu)域組成，其中SN結(jié)構(gòu)域主要參與細(xì)胞應(yīng)激、基因轉(zhuǎn)錄等過程，而TSN結(jié)構(gòu)域則主要參與premRNA的剪切過程[1-3]。目前從SND1基因多樣性角度分析SND1蛋白的多功能性較受學(xué)者關(guān)注。如斑馬魚SND1基因被報道存在兩個選擇性剪接異構(gòu)體SND1L和SND1S，其中SND1L占多數(shù)，即為SND1基因全長；SND1S則僅含SN1～3和部分SN4基因[8]。人類SND1 mRNA基因（NM_04390.2）5′端有兩個AUG，兩者之間相差75個bp，理論上分別以第1、2 個AUG為起始密碼子所翻譯的SND1-No1和SND1-No2蛋白的相對分子質(zhì)量相差25個氨基酸。然而，最初人們對于SND1基因的研究多始于第2個AUG，隨著研究的深入，第1個AUG才被確認(rèn)[1-5]。SND1基因的兩個AUG是否具有一定的生物學(xué)意義尚不明確。本實(shí)驗(yàn)中筆者以pCMV-N-Flag載體為基礎(chǔ)，分別針對人類SND1基因的兩個AUG設(shè)計引物，構(gòu)建pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質(zhì)粒，后者可在真核細(xì)胞中特異表達(dá)N端攜帶有Flag標(biāo)簽的SND1-No1/2蛋白。

本研究針對SND1基因的第2個AUG構(gòu)建了pERFP-SND1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞后成功表達(dá)紅色熒光蛋白標(biāo)記的SND1蛋白；當(dāng)給予細(xì)胞0.5 mmol/L亞砷酸鹽氧化應(yīng)激處理后，SND1蛋白可在胞漿中形成“應(yīng)激顆粒”[3]。“應(yīng)激顆?！笔窃诩?xì)胞受到氧化應(yīng)激、熱休克、紫外線照射、滲透壓休克和病毒感染等各種刺激時在胞漿中產(chǎn)生的顆粒狀結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞的一種重要保護(hù)機(jī)制，與多種臨床疾病相關(guān)[9]。本實(shí)驗(yàn)即是從“細(xì)胞應(yīng)激”角度探討第1個AUG是否在SND1蛋白應(yīng)激顆粒形成中發(fā)揮作用。結(jié)果表明以2 個AUG為起始密碼子所翻譯的Flag-SND1-No1和Flag-SND1-No2蛋白均可介導(dǎo)細(xì)胞SND1應(yīng)激顆粒的形成，說明第1個AUG在SND1應(yīng)激顆粒形成中的作用是冗余的。

雖然筆者針對SND1基因的2個AUG也進(jìn)行了“Kozak規(guī)則”的初步分析，并沒有發(fā)現(xiàn)兩者明顯的差異，但仍然無法排除兩個AUG在SND1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控或選擇性剪接中發(fā)揮作用的可能性，這需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的pCMV-N-Flag-SND1-No1/2真核重組質(zhì)粒有助于今后進(jìn)行此方面的探索。

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（2014-02-11收稿2014-03-19修回）

（本文編輯魏杰）

Analysis of Cellular Stress Response in Two AUG of Human SND1 Gene

GAO Xingjie1,HE Jinyan2,GE Lin2,ZHANG Yi3,FU Xue1,YIN Jie1,ZHANG Wei2,SHI Xuebin2,SU Zheng2, YAO Zhi2,YANG Jie1,2
1Research Center of Basic Medical Science,2 Basic Medical Collgee,3 College of Pharmacy,Tianjin Medical University, Tianjin 300070,China
YANG Jie,E-mail：yangj@tijmu.edu.cn

ObjectiveTo construct eukaryotic Flag(DYKDDDDK)expressing recombinant plasmids,pCMV-NFlag-SND1-No1/2,which contain the coding sequence of human SND1-No1（from 1stAUG）or SND1-No2(from 2ndAUG), and perform the cellular localization analysis of Flag-tagged SND1-No1/2 under stress condition to study the function of the two AUG in the SND1 containing stress granules formation.MethodsThe gene fragments of SND1-No1/2 were amplified by PCR from the whole SND1 transcript and inserted into pCMV-N-Flag expressing vector through BamHI/EcoRI double enzyme digestion and T4 DNA Ligase connection.The recombinant pCMV-N-Flag-SND1-No1/2 plasmids were transfected into HeLa cells and the expression of Flag-SND1-No1/2 fusion proteins was examined by Western blotting assay.Immunofluorescence assay was performed to detect the co-localization of Flag-SND1-No1/2 with endogenous SND1 granule.ResultsThe pCMV-N-Flag-SND1-No1/2 were sequenced and digested correctly by restriction single/double enzyme.The Flagtagged SND1-No1/2 fusion proteins were also detected in transfected HeLa cell by Western blotting assay.Both of them showed the co-localization with endogenous SND1 granule.ConclusionThe recombinant eukaryotic plasmids of pCMV-N-Flag-SND1-No1/2 were constructed successfully and expressed effectively.The depletion of 1stAUG failed to affect the formation of SND1 containing stress granules.

recombinant fusion proteins;stress;plasmids;gene expression;SND1;AUG;stress granules

Q784，Q513

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.001

國家自然科學(xué)基金資助項目（31100967，31170830, 31370749，21305103）；國家杰出青年基金項目（31125012）

1天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心（郵編300070），2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3藥學(xué)院

△通訊作者E-mail：yangj@tijmu.edu.cn