法夫酵母整合型表達(dá)載體的構(gòu)建

陳麗娜，朱艷冰，倪 輝，2，3，李利君

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021;2.福建省高校食品微生物與酶工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021;3.廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

蝦青素 (Astaxanthin)是一種抗氧化性極強(qiáng)的類胡蘿卜素，被廣泛應(yīng)用在食品、飼料、醫(yī)藥、化妝品、保健品等行業(yè)[1-6].法夫酵母(Phafia rhodozyma)發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素具有蝦青素積累量高、發(fā)酵周期短、不受氣候條件影響、發(fā)酵工藝容易滿足等優(yōu)點(diǎn)[7]，被認(rèn)為是最具產(chǎn)業(yè)化前景的天然蝦青素來(lái)源.野生型法夫酵母菌株的蝦青素產(chǎn)量只有400 μg/g左右[8]，經(jīng)過(guò)很多學(xué)者的改進(jìn)，目前法夫酵母菌株的蝦青素產(chǎn)量已經(jīng)提高至3000 μg/g[9].因此，選育高產(chǎn)菌種是提高蝦青素發(fā)酵產(chǎn)量的有效途徑.傳統(tǒng)的育種方法如誘變、原生質(zhì)體融合等雖然在20世紀(jì)最后20年發(fā)揮了重要的作用，但由于盲目性高、篩選工作量大和突變鈍化等問(wèn)題，已經(jīng)難以進(jìn)一步提高菌種的生產(chǎn)能力[10].利用DNA重組技術(shù)育種，通過(guò)構(gòu)建載體，有針對(duì)性地在載體上設(shè)計(jì)基因同源重組片段和篩選標(biāo)記基因，可以較好地解決以上問(wèn)題.但是，由于沒(méi)有針對(duì)法夫酵母開(kāi)發(fā)的商業(yè)化質(zhì)粒，要想從事相關(guān)的研究，首先需要構(gòu)建相應(yīng)的載體.法夫酵母的rRNA基因是多拷貝基因，在載體上插入該基因片段作為同源重組基因片段，可使載體高拷貝地整合到法夫酵母染色體上，并得到穩(wěn)定遺傳[10-12].如在載體攜帶的氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (aminoglycoside phosphotransferase gene，KmR)，用法夫酵母的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)，就能使對(duì)G418敏感的法夫酵母菌株獲得G418抗性[11-13].Wery等[11-12]就根據(jù)以上原理，成功構(gòu)建了法夫酵母的整合型載體pGB-Ph9和pPR2T，用于法夫酵母的DNA重組實(shí)驗(yàn).本文借鑒Wery等構(gòu)建載體的思路，以來(lái)源于法夫酵母本身的rRNA基因?yàn)榛蛲粗亟M片段，嘗試構(gòu)建攜帶G418抗性基因的整合型載體，并在法夫酵母染色體上整合并表達(dá)出G418抗性，為利用DNA重組技術(shù)選育法夫酵母的蝦青素高產(chǎn)菌株研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pET28a為Novagen公司產(chǎn)品;pMD18-T載體和限制性內(nèi)切酶為TaKaRa產(chǎn)品;酵母基因組DNA快速提取試劑盒、柱式DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶為東盛生物科技有限公司產(chǎn)品;G418為美國(guó)BIOSHARP產(chǎn)品;E.coli DH5α(DE3)菌株，法夫酵母JMU-MVP14、JMU-7B12、JMU-VDL668菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存;相關(guān)引物由華大基因合成;核酸序列的測(cè)定由英濰捷基 (上海)貿(mào)易公司完成;試劑均為國(guó)產(chǎn)化學(xué)純或分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī) (Eppendorf，德國(guó));PCR儀 (Eppendorf，德國(guó));蛋白分析儀 (Eppendorf，德國(guó));恒溫水浴鍋 (金壇市富華儀器有限公司，中國(guó));凝膠成像分析儀 (上海培清有限公司，中國(guó));基因?qū)雰x (寧波新芝生物科技股份有限公司，中國(guó));搖床 (上海智城分析儀器制造有限公司，中國(guó));隔水式培養(yǎng)箱(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司，中國(guó)).

1.3 引物

通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得法夫酵母中18S rRNA的核苷酸序列 (登錄號(hào)為D31656.1)、編碼肌動(dòng)蛋白 (actin)的核苷酸序列 (登錄號(hào)為X89898.1)、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)的核苷酸序列(登錄號(hào)為DQ002007.1)和編碼氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列 (Novagen公司提供的pET28a載體序列)設(shè)計(jì)構(gòu)建法夫酵母整合載體所用的引物，見(jiàn)表1.

表1 引物序列Tab.1 List of primers

1.4 法夫酵母對(duì)G418的敏感性研究

將3種法夫酵母菌株的菌液涂布于G418質(zhì)量濃度分別為0、50、100、150、200、250 μg/mL的YPD培養(yǎng)基平板上，22℃培養(yǎng)7 d，觀察3個(gè)菌株在平板上的生長(zhǎng)情況.

1.5 法夫酵母總DNA的提取

法夫酵母菌株JMU-MVP14培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，并用PBS緩沖液洗滌3遍.采用液氮研磨法破壁，直到菌體呈粉紅色粉末，稱取0.05 g粉末于離心管中，利用酵母基因組DNA快速提取試劑盒提取法夫酵母總DNA，保存于-20℃.

1.6 法夫酵母整合載體的構(gòu)建

1.6.1 載體元件的克隆 以法夫酵母總DNA為模板，分別利用18S rDNA-F/18S rDNA-R、Pactin-F/Pactin-R、Tactin-F/Tactin-R、Pgpd-F/Pgpd-R、Tgpd-F/Tgpd-R引物擴(kuò)增法夫酵母的18S rRNA基因、actin啟動(dòng)子、actin終止子、gpd啟動(dòng)子、gpd終止子.以pET28a質(zhì)粒為模板，利用kna-F/kna-R為引物擴(kuò)增KmR基因，將PCR產(chǎn)物割膠回收.分別以AknaB-F/AknaB-R、GknaA-F/GknaA-R為引物利用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增Pact-KmR-Tact(兩端含BamHI限制性酶切位點(diǎn))及Pgpd-KmR-Tgpd(兩端含AatII限制性酶切位點(diǎn))兩個(gè)片段，凝膠回收重疊PCR產(chǎn)物.

1.6.2 載體元件的連接 1)通過(guò)T克隆將18S rRNA基因片段連接到pMD18-T載體的T克隆位點(diǎn)上，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化、篩選、提取等步驟得到質(zhì)粒pMD-18s.2)用BamHI酶切Pact-KmR-Tact片段和pMD-18s質(zhì)粒，用AatII酶切Pgpd-KmR-Tgpd片段和pMD-18s質(zhì)粒，再用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物.3)使用CIAP去磷酸化酶將酶切回收的pMD-18s載體的5'端去磷酸化，37℃反應(yīng)6 h，然后85℃加熱15 min使CIAP去磷酸化酶失活，再用凝膠回收試劑盒回收質(zhì)粒片段.4)用T4DNA ligase將Pact-KmR-Tact和Pgpd-KmR-Tgpd片段連接到pMD-18s質(zhì)粒上，分別得到質(zhì)粒pMD-18spakta和pMD-18spgktg.

1.7 整合載體轉(zhuǎn)化法夫酵母細(xì)胞

從新鮮培養(yǎng)的法夫酵母菌株JMU-MVP14平板中挑取單菌落接種于30 mL YPD培養(yǎng)基中，22℃、180 r/min培養(yǎng)3 d.以1∶100的比例將上述菌液轉(zhuǎn)接到100 mL YPD培養(yǎng)基，22℃、180 r/min培養(yǎng)，參照文獻(xiàn) [13]中的方法，取不同生長(zhǎng)期 (OD600，1.0～1.5，2.0～2.5)的法夫酵母菌體制備感受態(tài)細(xì)胞.用SacII限制性內(nèi)切酶酶切pMD-18spakta質(zhì)粒和pMD-18spgktg質(zhì)粒，然后用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物.取60 μL感受態(tài)細(xì)胞與6 μL線性化質(zhì)?；靹蜣D(zhuǎn)移到電擊杯中冰浴5 min，設(shè)置電轉(zhuǎn)化參數(shù) (U=1000，1200，1500 V;R=200 Ω;C=25 μF)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn).

1.8 轉(zhuǎn)化結(jié)果檢驗(yàn)

電轉(zhuǎn)化后菌液22℃孵育2.5 h，取150 μL菌液涂布于含20 μg/mL G418的YPD培養(yǎng)基平板，22℃恒溫培養(yǎng)直至菌落長(zhǎng)出.從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)選取單菌落，挑取菌體重懸于10 μL的水中，并加入5 μL的溶壁酶litycase(5 U/μL)，30℃孵育10 min，再將樣品凍浸入液氮中1 min.以該溶液為模板，kna-F/kna-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化結(jié)果.

2 結(jié)果

2.1 法夫酵母的G418敏感性

將3株不同的法夫酵母菌株JMU-7B12、JMU-VDL668、JMU-MVP14涂布于含不同濃度G418的平板上培養(yǎng)，考察這些菌株對(duì)G418的敏感性，結(jié)果見(jiàn)表2.JMU-7B12、JMU-VDL668菌株在含有50～250 μg/mL G418的平板上均有部分菌落生長(zhǎng)，可見(jiàn)這2株菌對(duì)G418不敏感.相比之下，JMUMVP14菌株對(duì)G418較為敏感，當(dāng)平板中G418的質(zhì)量濃度為50 μg/L時(shí)，JMU-MVP14菌株的生長(zhǎng)就被完全抑制，因此，選擇法夫酵母JMU-MVP14菌株作為整合載體電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的宿主.

為了找到合適的G418篩選質(zhì)量濃度，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定了抑制JMU-MVP14菌株生長(zhǎng)所需的最低G418濃度，結(jié)果見(jiàn)表3.當(dāng)ρ(G418)〈20 μg/mL時(shí)，JMU-MVP14菌株可以生長(zhǎng);當(dāng)ρ(G418)≥20 μg/mL時(shí)，JMU-MVP14菌株完全被抑制生長(zhǎng)，所以20 μg/mL可作為整合載體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的G418篩選質(zhì)量濃度.

表2 法夫酵母菌株對(duì)G418的敏感性結(jié)果Tab.2 The sensitivity results of P.rhodozyma strains for G418

表3 法夫酵母菌株JMU-MVP14對(duì)G418的敏感性結(jié)果Tab.3 The sensitivity results of JMU-MVP14 strain for G418

2.2 法夫酵母總DNA的提取

利用酵母基因組DNA快速提取試劑盒從法夫酵母菌株JMU-MVP14的菌體中提取總DNA，取3 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示.由圖1可見(jiàn)，總DNA條帶明亮、拖尾較少.利用蛋白分析儀測(cè)得法夫酵母總DNA的A260/280為1.81，純度較高，可用作后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)的模板.

2.3 整合載體的構(gòu)建

以法夫酵母總DNA為模板，利用18S rDNA-F/18S rDNA-R為引物擴(kuò)增獲得法夫酵母的18S rRNA基因片段約1.5 kb;利用引物對(duì)Pactin-F/Pactin-R、Tactin-F/Tactin-R、Pgpd-F/Pgpd-R、Tgpd-F/Tgpd-R分別克隆得到actin啟動(dòng)子、actin終止子、gpd啟動(dòng)子、gpd終止子;以pET28a質(zhì)粒為模板，利用kna-F/kna-R為引物擴(kuò)增獲得KmR基因.運(yùn)用重疊PCR將啟動(dòng)子序列連接到KmR基因的5'端，將終止子序列連接到Km 基因的3'端，分別得到重組片段Pact-Km Tact和Pgpd-KmR-Tgpd，大小都約2.0 kb.

將克隆好的各部分元件，按照?qǐng)D2所示流程逐步完成載體的構(gòu)建.首先在質(zhì)粒pMD18-T的T克隆位點(diǎn)插入18S rRNA基因片段，得到質(zhì)粒pMD-18s，再在質(zhì)粒pMD-18s的多克隆位點(diǎn)插入Pact-KmR-Tact片段和Pgpd-KmR-Tgpd片段，分別得到質(zhì)粒pMD-18spakta和質(zhì)粒pMD-18spgktg.通過(guò)酶切 (見(jiàn)圖3)和測(cè)序各部分元件的連接順序和酶切位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明2個(gè)載體構(gòu)建正確.

圖1 法夫酵母的總DNAFig.1 Total DNA of Phaffia rhodozyma

2.4 整合載體轉(zhuǎn)化法夫酵母細(xì)胞

載體的轉(zhuǎn)化效率與制備感受態(tài)時(shí)菌體細(xì)胞所處的生長(zhǎng)狀態(tài)有非常大的關(guān)系.在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)菌體的OD600=1.0～1.5時(shí)制備的感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效果最好.電轉(zhuǎn)化時(shí)的電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)轉(zhuǎn)化效率和菌體存活率也有很大的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為5 kV/cm時(shí)，法夫酵母的電轉(zhuǎn)化效率最高，假陽(yáng)性菌落數(shù)的比例最大，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度增大，法夫酵母的電轉(zhuǎn)化效率降低，同時(shí)假陽(yáng)性菌落所占比例減小.

表4 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Tab.4 Effect of field strength on transformation frequency

圖2 法夫酵母整合載體構(gòu)建流程圖Fig.2 The flow chart of constructing the integration vector of Phaffia rhodozyma

圖3 質(zhì)粒酶切鑒定Fig.3 Identification of plasmids digesting with restriction enzymes

2.5 轉(zhuǎn)化結(jié)果的檢驗(yàn)

隨機(jī)選取G418抗性平板上的單菌落，挑取適量菌體，破壁，制成溶液，以該溶液為模板，kna-F/kna-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子可克隆得到約800 bp的條帶，而假陽(yáng)性和空白對(duì)照菌則克隆不出任何條帶.本實(shí)驗(yàn)選取的菌落驗(yàn)證結(jié)果如圖4，選取的7個(gè)pMD-18spakta質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌中，1—4為陽(yáng)性克隆，5—7為假陽(yáng)性菌，選取的7個(gè)pMD-18spgktg質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌中，8—13為陽(yáng)性克隆，14為假陽(yáng)性菌.分別挑取3號(hào)和8號(hào)菌接種于裝有30 mL YPD培養(yǎng)基 (含G418)的三角瓶中，22℃，180 r/min培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)10次后，2個(gè)菌株仍可以在含20 μg/mL G418的培養(yǎng)基中生長(zhǎng).以2個(gè)菌株的DNA為模板，利用引物kna-F/kna-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到約800 bp的條帶，見(jiàn)圖5.

圖4 菌落PCR產(chǎn)物Fig.4 Products of colony PCR

圖5 菌液PCR產(chǎn)物Fig.5 PCR products of incubating medium

3 討論

對(duì)不同法夫酵母菌株JMU-MVP14、JMU-VDL668、JMU-7B12的G418敏感性研究發(fā)現(xiàn)，JMUMVP14菌株對(duì)G418最敏感，可作為載體電轉(zhuǎn)化的宿主.G418的質(zhì)量濃度過(guò)高不利于轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)，質(zhì)量濃度過(guò)低則平板上會(huì)出現(xiàn)較多的假陽(yáng)性克隆，增加篩選的工作量.因此，合適的G418濃度是獲得轉(zhuǎn)化子的關(guān)鍵.本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定了抑制JMU-MVP14菌株生長(zhǎng)所需的最低G418質(zhì)量濃度.從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，當(dāng)G418質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，JMU-MVP14菌株就能完全被抑制生長(zhǎng)，因此以20 μg/mL作為G418的篩選濃度.

以來(lái)源于法夫酵母本身的18S rRNA基因?yàn)橥粗亟M片段，分別利用法夫酵母本身的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (KmR)的表達(dá)，構(gòu)建得到法夫酵母的整合型載體pMD-18spakta和pMD-18spgktg，酶切鑒定以及測(cè)序分析都表明整合載體構(gòu)建正確.

取不同生長(zhǎng)狀態(tài)下的法夫酵母細(xì)胞制備感受態(tài)，并在不同的電壓下完成電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)菌體的OD600=1.0～1.5時(shí)制備的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效果最好，這與Faber等[14]研究發(fā)現(xiàn)菌體細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期時(shí)制備的感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率最高的報(bào)道相符.轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中電壓也是實(shí)現(xiàn)電擊轉(zhuǎn)化的重要參數(shù)，一般認(rèn)為，電穿孔作用是通過(guò)觸發(fā)細(xì)胞膜的電通透性增大，形成電致孔洞，從而使DNA等多種生物大分子進(jìn)出細(xì)胞.在電擊過(guò)程中，電壓過(guò)低，細(xì)胞不宜極化產(chǎn)生微孔通道，質(zhì)粒DNA不能進(jìn)入細(xì)胞，無(wú)法完成轉(zhuǎn)化;電壓過(guò)高，導(dǎo)致大部分細(xì)胞因孔洞形成較大，難以復(fù)原而死亡.法夫酵母的細(xì)胞壁較厚，含有豐富的糖蛋白，載體轉(zhuǎn)化的難度較大.本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為5 kV/cm時(shí)，法夫酵母的電擊轉(zhuǎn)化效率最高，假陽(yáng)性菌落數(shù)的比例也最大，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度增大，法夫酵母的電擊轉(zhuǎn)化效率降低，同時(shí)假陽(yáng)性菌落所占比例減小.綜合考慮載體的轉(zhuǎn)化效率和菌體的存活率，選擇6 kV/cm作為法夫酵母電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的最佳電場(chǎng)強(qiáng)度.

整合載體pMD-18spakta和pMD-18spgktg用限制性內(nèi)切酶SacII線性化后分別電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入法夫酵母細(xì)胞，質(zhì)粒通過(guò)18S rRNA基因發(fā)生同源重組整合到法夫酵母細(xì)胞染色體上，導(dǎo)致KmR基因插入到染色體中，并在啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，使法夫酵母具有G418抗性.通過(guò)G418抗性平板的篩選和菌落PCR的鑒定，獲得載體成功整合到細(xì)胞染色體上并表達(dá)出G418抗性的法夫酵母菌株，該菌株能夠在含20 μg/mL G418的YPD平板上生長(zhǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)10次后菌株仍具有G418抗性.通過(guò)PCR驗(yàn)證，菌株的DNA依然攜帶整合上去的KmR基因，說(shuō)明載體整合到法夫酵母染色體上后得到穩(wěn)定遺傳.在轉(zhuǎn)化子的篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，G418抗性平板上有較大比例的假陽(yáng)性克隆存在，這可能是因?yàn)?個(gè)載體整合到法夫酵母細(xì)胞染色體上都是通過(guò)一次同源重組，比較不穩(wěn)定，部分轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生回復(fù)突變[15];還可能是因?yàn)楸硇脱舆t[16]，整合載體轉(zhuǎn)化到法夫酵母細(xì)胞后只在染色體的一條鏈上進(jìn)行rRNA基因位點(diǎn)的整合，在細(xì)胞分裂增殖過(guò)程中，產(chǎn)生未發(fā)生載體整合的細(xì)胞，當(dāng)有G418抗性的細(xì)胞將環(huán)境中的G418分解后，沒(méi)有抗性的細(xì)胞得以優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng).

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