高效液相色譜法測(cè)定水果中常見的4種糖和糖醇

黃 蕊，吳光斌，陳發(fā)河

(集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

果實(shí)內(nèi)可溶性糖的種類與含量是影響果實(shí)品質(zhì)的重要因素．這些可溶性糖不僅是影響果實(shí)甜度的物質(zhì)，同時(shí)也是酸、類胡蘿卜素、維生素C等營(yíng)養(yǎng)成分及芳香物質(zhì)等合成的基礎(chǔ)原料[1]．果實(shí)中的常見的可溶性糖主要包括蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇等[2－4]，其中山梨醇屬于糖醇類，是山梨糖的還原產(chǎn)物．它本身是一種小分子滲透物質(zhì)，在改變細(xì)胞滲透壓[5]、提高植物抗寒力[6]、清除活性氧[7]等方面起著重要的作用．因此，準(zhǔn)確測(cè)定山梨醇含量對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品采后貯藏保鮮機(jī)理的研究十分重要．

通常糖的測(cè)定方法有比色法 蒽酮－硫酸法 硫酸－咔唑法 氣相色譜法 等．一般的化學(xué)方法只能測(cè)定總糖的含量，不能測(cè)定糖的組成．氣相色譜法雖然可以測(cè)定糖的組成，但必須對(duì)糖進(jìn)行衍生化才可以檢測(cè)，檢測(cè)步驟繁瑣，且不可避免地會(huì)產(chǎn)生誤差[11]．而高效液相色譜法卻可以彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)，從而在糖類化合物的測(cè)定中得到了廣泛的應(yīng)用[2－3]．然而目前，關(guān)于果品中蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇這4種糖的分離及含量的測(cè)定方法鮮有報(bào)道，而實(shí)際中將這4種糖和糖醇完全分離并實(shí)現(xiàn)同時(shí)一次檢測(cè)也較為困難．本文建立了利用高效液相色譜法分離并同時(shí)測(cè)定水果中葡萄糖、果糖、蔗糖及山梨醇含量的技術(shù)方法．

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蓮霧 (黑珍珠)，購(gòu)自廈門臺(tái)灣水果集散中心;枇杷 (早鐘6號(hào))，福建省莆田縣;柚子 (琯溪蜜柚)，福建省平和縣．

果糖、葡萄糖、山梨醇和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司;乙腈，色譜純，美國(guó)天地公司;無(wú)水乙醇，分析純，中國(guó)國(guó)藥集團(tuán);實(shí)驗(yàn)用水 (18.2 MΩ·cm)由本實(shí)驗(yàn)室用Millipore Milli Q RG超純水系統(tǒng)制備．

1525型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司．

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取一定量的果肉，置于研缽中，向其中加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈水溶液，研磨勻漿，定容至25 mL，常溫離心 (4000 r/min，30 min)，取上清液，進(jìn)樣前通過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾．

1.2.2 HPLC測(cè)定條件

XBridge Amide Column(3.5 μm，4.6 mm ×250 mm，Waters);流動(dòng)相為 V(乙腈)∶V(水)=85∶15，并含體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水;流速1.5 mL/min;柱溫45℃;進(jìn)樣量20 μL;Waters 1525泵;Waters 2414折光指數(shù)檢測(cè)器．以保留時(shí)間定性，峰面積定量．

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取0.5 g(精確至0.0001 g)經(jīng)干燥恒重的果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，得質(zhì)量濃度為20 mg/mL的混標(biāo)母液，逐級(jí)稀釋至0.2、0.4、1、5、10、20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液．進(jìn)樣前通過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾．

2 結(jié)果

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

首先采用Waters XBridge Amide Column以不同體積比的流動(dòng)相 (V(乙腈)∶V(水)=75∶25、80∶20、85∶15、90∶10)來(lái)測(cè)定混標(biāo)液和樣品提取液中果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的分離情況．結(jié)果表明，增加水相比例可以縮短分析時(shí)間，但會(huì)降低分離度，造成果糖、山梨醇和葡萄糖色譜峰的重疊;隨著乙腈比例的增加，4種糖的分離度提高，但相應(yīng)的分析時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)．當(dāng)流動(dòng)相中V(乙腈)∶V(水)=85∶15時(shí)，4種糖的分離效果較好．但是，流動(dòng)相僅為乙腈水溶液時(shí)，果糖峰形不佳，葡萄糖存在旋光異構(gòu)體，因此，分別嘗試在流動(dòng)相中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%乙酸銨和體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水以改善峰形．結(jié)果表明，在流動(dòng)相添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%乙酸銨時(shí)，測(cè)定結(jié)果會(huì)在果糖色譜峰附近出現(xiàn)溶劑倒峰，無(wú)法準(zhǔn)確定量;而添加體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水時(shí)，4種糖的色譜峰峰形得到改善，分離度均大于1.5．因此，在兼顧分離度、峰形及分析時(shí)間的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用的流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=85∶15，并含有體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水．

2.1.2 流速的選擇

比較流速在1.0、1.2、1.3、1.4、1.5 mL/min條件下4種糖的分離情況，發(fā)現(xiàn)在流速為1.5 mL/min時(shí)，4種糖的出峰時(shí)間較快，分離度均達(dá)1.5以上，峰形較好．

2.1.3 色譜柱溫度的選擇

在30、35、40、45、50℃條件下進(jìn)行混標(biāo)液和樣品提取液中可溶性糖的分析，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，4種糖的保留時(shí)間有所縮短，但分離度降低．兼顧分離度和保留時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)采用色譜柱柱溫為45℃．

2.2 方法的線性范圍和檢出限

按1.2.2中的分析條件進(jìn)行測(cè)定，以不同糖濃度混標(biāo)峰面積y為縱坐標(biāo)，標(biāo)樣質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以信噪比S/N=3計(jì)算果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖的檢出限，以信噪比S/N=10計(jì)算它們的定量限，標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限、定量限見表1．試驗(yàn)結(jié)果表明，果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖在0.2～20 mg/mL范圍內(nèi)，濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.9999．

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限、定量限Tab.1 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges and detection limit，quantification limit for fructose，sorbitol，glucose and sucrose

2.3 色譜圖

在1.3.2色譜條件下，得到果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖標(biāo)樣的色譜圖，相鄰峰均能達(dá)到完全分離 (見圖1)．

圖1 果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的混標(biāo)色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the standard of mixed fructose,sorbitol,glucose and sucrose

2.4 加標(biāo)回收率與精密度

取適量的樣品，按線性檢測(cè)范圍加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，然后進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)[13]，平行測(cè)定6次，結(jié)果如表2所示．結(jié)果表明，果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的回收率在97.07% ～100.11%，說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確度．

平行測(cè)定6次，測(cè)定峰面積，通過(guò)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)考察此方法的精密度，經(jīng)測(cè)定，果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖峰面積的RSD分別為1.34%、1.26%、1.07%、0.79%，結(jié)果表明該方法的精密度良好．

2.5 樣品分析

按照1.2.2色譜條件分別對(duì)蓮霧果實(shí)、枇杷果實(shí)及柚子果實(shí)樣品進(jìn)行分析，測(cè)得采后蓮霧果實(shí)中的可溶性糖主要為果糖、葡萄糖和蔗糖，采后枇杷果實(shí)中的可溶性糖主要為果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖，采后柚子果實(shí)中的可溶性糖主要為果糖、葡萄糖和蔗糖，樣品色譜圖見圖2—圖4，樣品中可溶性糖含量結(jié)果見表3．

表2 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab．2 Spike recoveries and relative standard deviations in a real sample(n=6)

圖2 蓮霧果實(shí)樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of Syzygium samarangense

圖3 枇杷果實(shí)樣品色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Eriobotrya japonica(Thumb.)Lindl.

圖4 柚子果實(shí)樣品色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of Citrus grandis Osbeck

表3 果品中可溶性糖的含量Tab．3 The concentration of soluble sugar in fruits

3 討論

葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇在大部分果實(shí)所含的糖類組分中均占有較高的比例，它們直接影響到果實(shí)的感官品質(zhì)．目前同時(shí)測(cè)定葡萄糖、果糖、蔗糖的方法報(bào)道較多，但利用HPLC－示差檢測(cè)器同時(shí)分離測(cè)定水果中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇的研究報(bào)道很少，本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜－示差檢測(cè)器和酰胺柱成功地分離了水果中這4種糖和糖醇．與Kelebek Hasim等[14]、劉勝輝等[15]、孟伊娜等[16]的研究對(duì)比，這一方法簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟，實(shí)現(xiàn)了4種糖和糖醇的同時(shí)分離測(cè)定．該方法的建立，不僅提高了檢測(cè)效率，也節(jié)省了分析時(shí)間．本方法可廣泛應(yīng)用于各類水果、蔬菜等所含的葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇的同時(shí)分離測(cè)定．

4 結(jié)論

本研究建立了用高效液相色譜法分離并測(cè)定果品中葡萄糖、果糖、蔗糖及山梨醇含量的方法體系，結(jié)果表明，該方法中4種糖的分離度均達(dá)到1.5以上，保留時(shí)間重現(xiàn)性較好，加標(biāo)回收率準(zhǔn)確性高，并且由于本研究中樣品前處理方法簡(jiǎn)便、快速，因此可作為分析檢測(cè)水果中可溶性糖組分和含量的一種簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確的方法．

[1]王晨，房經(jīng)貴，王濤，等．果樹果實(shí)中的糖代謝[J]．浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21(5):529-534．

[2]張麗麗，劉威生，劉有春，等．高效液相色譜法測(cè)定5個(gè)杏品種的糖和酸 [J]．果樹學(xué)報(bào)，2010，27(1):119-123．

[3]胡志群，王惠聰，胡桂兵．高效液相色譜法測(cè)定荔枝果肉中的糖、酸和維生素C[J]．果樹學(xué)報(bào)，2005，22(5):582-585．

[4]吳國(guó)良，蔡華成，張宏平，等．扁桃果實(shí)發(fā)育期果肉組織糖含量及相關(guān)酶活性的變化 [J]．果樹學(xué)報(bào)，2012，29(4):605-610．

[5]BELLALOUI N，BROWN P H，DANDEKAR A M．Manipulation of in vivo sorbitol productionalters boron uptake and transport in tobacco[J]．Plant Physiology，1999，119(2):735-742．

[6]WANG S Y，STEFFENS G L，F(xiàn)AUST M．Effect of paclobutrazol on accumulation of carbohydrates on applewood [J]．Hort Sci，1986，21(6):1419-1421．

[7]SMIRNOFF N，CUMBES Q J．Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J]．Phytochemistry，1989，28(4):1057-1060．

[8]孫偉偉，曹維強(qiáng)，王靜．DNS法測(cè)定玉米秸稈中總糖 [J]．食品研究與開發(fā)，2006，27(6):120-123．

[9]張惟杰．復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M]．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1987．

[10]林穎，黃琳娟，田庚元．一種改良的糖醛酸含量測(cè)定方法 [J]．中草藥，1999，30(11):817-819．

[11]王靜，王晴．色譜法在糖類化合物分析中的應(yīng)用 [J]．分析化學(xué)，2001，29(2):222-227．

[12]陳靜，吳光斌，陳發(fā)河．HPLC測(cè)定采后蓮霧果實(shí)中可溶性糖含量及其在貯藏期的變化 [J]．食品與機(jī)械，2012，28(6):103-105．

[13]逯平杰，代容春，葉冰瑩，等．高效液相色譜法測(cè)定甘蔗節(jié)間果糖、葡萄糖和蔗糖的含量 [J]．食品科學(xué)，2011，32(2):198-200．

[14]KELEBEK H，SELLI S，CANBAS A，et al．HPLC determination of organic acids，sugars，phenolic compositions and antioxidant capacity of orange juice and orange wine made from a Turkish cv．Kozan[J]．Microchemical Journal，2009，91:187-192．

[15]劉勝輝，魏長(zhǎng)賓，孫光明，等．高效液相色譜法測(cè)定臺(tái)農(nóng)6號(hào)菠蘿果實(shí)中的糖分 [J]．食品科學(xué)，2009，30(2):162-164．

[16]孟伊娜，張瑞廷，史強(qiáng)，等．高效液相色譜法測(cè)定甜高粱莖稈中3種糖含量 [J]．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26(8):90-95．