蛋白核小球藻在沼液中的擴(kuò)大培養(yǎng)及其成分研究

高坤煌，鄭 江，陳歡林，唐 花，蔡絲萍，孫 誠，周紀(jì)新

(1．集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021;2．浙江大學(xué)生物工程研究所，浙江 杭州 310027;3．福建龍巖順添環(huán)?？萍加邢薰?，福建 龍巖 364000)

0 引言

畜禽養(yǎng)殖中，以沼氣生產(chǎn)為主的能源生態(tài)型沼氣工程雖然大大減少了養(yǎng)殖廢棄物的直接排放，但是在實(shí)際應(yīng)用中，沼氣工程產(chǎn)生大量的沼氣廢液 (簡稱沼液)，其中含有多種氨基酸、有機(jī)質(zhì)以及氮、磷等營養(yǎng)元素，如果直接排放，易引起水體富營養(yǎng)化，對(duì)環(huán)境造成二次污染[1]．

微藻對(duì)于食品加工廢水、畜禽養(yǎng)殖廢水和工業(yè)廢水中的氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)都具有一定的清除效果．李玉寶等 利用螺旋藻處理沼氣廢液的結(jié)果表明，螺旋藻不能夠在沼液中直接生長，但在添加10%(體積分?jǐn)?shù))Zarrouk培養(yǎng)液的沼液中生長良好，且對(duì)沼液中硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、活性磷都有較好的去除效果．Zheng等[3]利用沼液培養(yǎng)蛋白核小球藻，結(jié)果表明，蛋白核小球藻能夠在沼液中直接生長，并且對(duì)沼液中的活性磷、氨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮有較好的凈化效果．Rupert等[4]在高效率海藻塘中處理污水，結(jié)果表明海藻對(duì)污水中BOD5、氨態(tài)氮和活性磷都有一定的去除作用．因此，利用微藻處理廢水是一種可行的策略．

小球藻(Chlorella pyrenoidosa)是一類單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門、綠藻綱、小球藻屬．小球藻廣泛分布于自然界，以淡水水域種類最多，且易于培養(yǎng)，它不僅能利用光能自養(yǎng)，還能利用有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長[5]．小球藻含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、食用纖維、維生素、微量元素和生物活性物質(zhì)[6－7]，在飼料、食品、醫(yī)藥等方面都有廣泛的應(yīng)用[5]．有研究表明，小球藻對(duì)光照、溫度、鹽度和酸堿性等都具有較大的耐受范圍，適應(yīng)能力較強(qiáng)[8]且能夠吸收、利用水體中的氮、磷等營養(yǎng)元素和有機(jī)物進(jìn)行混養(yǎng)生長[9]．因此，利用沼液培養(yǎng)小球藻，不僅能凈化沼液，而且收獲的小球藻還可用于微藻生理活性物質(zhì)以及飼料、添加劑的開發(fā)．

本文擬研究小球藻在沼液中的擴(kuò)大培養(yǎng)，探討其對(duì)氨態(tài)氮和活性磷的清除效果，并研究沼液培養(yǎng)的小球藻的營養(yǎng)成分變化，旨為沼液的凈化處理以及小球藻的培養(yǎng)提供理論和技術(shù)參考．

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)液

藻種:蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)由集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院藻種室提供．

正常培養(yǎng):采用仿f/2培養(yǎng)基，其具體配方有5種．A配方:NaNO374.8mg/L，B配方:KH2PO44.4 mg/L，C配方:Na2SiO310 mg/L，D配方:C6H5FeO73.9 mg/L，E配方:ZnSO423μg/L、MnCl2·4H2O 178 μg/L、CaCl2·6H2O 12 μg/L、Na2MoO4·2H2O 7.3μg/L、CuSO4·5H2O 10μg/L、NaEDTA·2H2O 4.35μg/L．

試驗(yàn)前，以仿f/2培養(yǎng)液為培養(yǎng)基，將小球藻置于PGX－280型光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度22℃，光照強(qiáng)度3500 lx，12 h光照－12 h黑暗循環(huán)．待小球藻處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，以此為實(shí)驗(yàn)用小球藻原液．

沼液培養(yǎng):沼液由龍巖順添環(huán)保科技有限公司提供．初始沼液為灰黑色渾濁液，含有固體顆粒物和微生物．初始沼液經(jīng)沉淀、濾去固體顆粒物、陽光下曝氣3 d后，呈澄清的棕色．經(jīng)處理后的沼液不經(jīng)過稀釋直接用于小球藻的培養(yǎng)．

1.2 方法

1.2.1 小球藻擴(kuò)大培養(yǎng)

在擴(kuò)大培養(yǎng)池 (2.5 m×2 m×0.5 m)中，按接種密度OD680=0.15將小球藻接種于沼液中，培養(yǎng)條件為自然環(huán)境條件 (溫度20～30℃，pH 6.7～7.5，光照5000～15000 lx)，同時(shí)設(shè)一不加藻液的對(duì)照組．每隔3 d取樣，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)小球藻的細(xì)胞數(shù)量，測(cè)定小球藻的生長狀況;每2 d從培養(yǎng)池的3個(gè)不同點(diǎn)取樣，按雷衍之的方法[10]測(cè)定水體中的氨態(tài)氮和活性磷含量．在培養(yǎng)后期，將小球藻過濾、離心、烘干、收獲，并測(cè)定其蛋白質(zhì)、脂肪及葉綠素的含量．

1.2.2 小球藻比生長速率的計(jì)算

根據(jù)藻細(xì)胞密度，依據(jù)公式μ=(Nt1-Nt2)/△t，計(jì)算小球藻的比生長速率，其中:μ為比生長速率;Nt1和Nt2分別為t1和t2時(shí)刻藻細(xì)胞的濃度;△t為t1、t22次測(cè)定之間的時(shí)間間隔．

1.2.3 小球藻蛋白質(zhì)、脂肪、葉綠素含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用凱氏定氮法 (GB 5009.5—2010)進(jìn)行測(cè)定．脂肪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用香草醛比色法[11]進(jìn)行測(cè)定．

葉綠素的質(zhì)量濃度按乙醇提取法 測(cè)定，具體計(jì)算公式計(jì)算如下:

葉綠素a的質(zhì)量濃度 (mg/L):ρCa=13．95A665nm－6．88A649nm，

葉綠素 b的質(zhì)量濃度 (mg/L):ρCb=24．96A649nm-7．32A665nm，

類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度 (mg/L):ρCx．c=(1000A470nm-2．05ρCa-114．8ρCb)/245 ．

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件中的t檢驗(yàn)函數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P≤0.05為顯著差異，P≤0.01為極顯著差異．

2 結(jié)果

2.1 小球藻在沼液中的生長狀況

在擴(kuò)大培養(yǎng)條件下，蛋白核小球藻在沼液中的生長狀況見圖1．從接種開始至第15天小球藻的細(xì)胞濃度基本不變，處于調(diào)整期．隨后小球藻的細(xì)胞濃度迅速增加，最大比生長速率達(dá)到3.2×106cells·(mL·d)－1．第21天細(xì)胞濃度達(dá)到最大，為1.98×107cells·mL－1，隨后細(xì)胞濃度逐漸下降．

圖1 擴(kuò)大培養(yǎng)條件下，小球藻在沼液中的生長狀況Fig.1 Growth of C.pyrenoidosa in biogas wastewater under the large scale cultivation condition

2.2 小球藻對(duì)沼液的凈化

圖2顯示，在擴(kuò)大培養(yǎng)條件下，沼液中的氨態(tài)氮和活性磷的濃度都在逐漸減少，與對(duì)照組相比氨態(tài)氮的濃度迅速降低．在第10天氨態(tài)氮就被完全清除，而對(duì)照組的氨態(tài)氮濃度變化不明顯．對(duì)照組中活性磷濃度在培養(yǎng)前期稍有降低，之后維持不變．實(shí)驗(yàn)組活性磷的濃度在培養(yǎng)前期迅速降低，隨后活性磷濃度變化不大，第16天—第20天活性磷濃度再次迅速降低，20 d后，活性磷濃度基本維持不變，經(jīng)過24 d的培養(yǎng)，小球藻對(duì)活性磷的清除率達(dá)到62.5%．由此可見，在擴(kuò)大培養(yǎng)條件下，小球藻對(duì)沼液中的氮、磷元素都有較好的吸收去除效果．

圖2 小球藻在擴(kuò)大條件下對(duì)沼液中氨態(tài)氮和活性磷的凈化效果Fig.2 Elimination of ammonia nitrogen and active phosphorus by C.pyrenoidosa under the large scale cultivation condition

2.3 蛋白質(zhì)、脂肪和色素含量

圖3顯示，沼液培養(yǎng)的小球藻蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于正常培養(yǎng)液培養(yǎng)的小球藻(P〈0.01)，而脂肪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻明顯高于正常培養(yǎng)液培養(yǎng)的小球藻(P〈0.01)，這表明沼液不利于小球藻蛋白質(zhì)的合成，而有利于脂肪的合成．

圖4表明，沼液培養(yǎng)的小球藻，其葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量都顯著高于正常培養(yǎng)的小球藻(P〈0.01)．從圖5也可看出，正常培養(yǎng)的小球藻外觀呈淺綠色，而沼液培養(yǎng)的小球藻外觀呈深綠色，這進(jìn)一步證明沼液培養(yǎng)的小球藻有較高的色素含量．

圖3 正常培養(yǎng)液和沼液培養(yǎng)的小球藻的蛋白和脂肪含量Fig.3 The protein and fat contents of C.pyrenoidosa under the normal culture and biogas wastewater

圖4 正常培養(yǎng)液和沼液培養(yǎng)的小球藻的色素含量Fig.4 The chlorophyll contents of C.pyrenoidosa under the normal culture and biogas wastewater

圖5 正常培養(yǎng)液和沼液培養(yǎng)的小球藻的外觀Fig.5 Apperance of C.pyrenoidosa under the normal culture and biogas wastewater

3 討論

小球藻在廢水培養(yǎng)中出現(xiàn)調(diào)整期是一種普遍現(xiàn)象，周連寧等[13]和陳春云等[14]分別利用豆制品廢水和養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻，其培養(yǎng)過程中均出現(xiàn)明顯的調(diào)整期．本研究也表明，利用沼液培養(yǎng)小球藻也有明顯的調(diào)整期．這可能與沼液中高濃度的氮、磷、有機(jī)物對(duì)于小球藻的生長具有一定的抑制作用[7，15]有關(guān)．

小球藻對(duì)于沼液中氨態(tài)氮及活性磷具有較高的去除效率，對(duì)氨態(tài)氮和活性磷的去除率分別可達(dá)100%和62.5%．說明蛋白核小球藻能夠處理沼液，降低沼液中氨態(tài)氮及活性磷的含量．周連寧等[13]利用小球藻處理豆制品廢水，總氮和總磷的去除率分別為64.2%和84.9%，李君榮等[16]利用小球藻處理豬場(chǎng)廢水，總氮和總磷的去除效率分別為79.69%和87.14%，這些與本文的研究結(jié)果基本一致．蛋白核小球藻能夠在未稀釋的沼液中生長，且對(duì)沼液中的氮、磷具有較高的清除效果，因此利用小球藻處理沼液是可行的．

沼液是微生物厭氧發(fā)酵的產(chǎn)物，其成分復(fù)雜，除含有氮、磷等無機(jī)元素外，還含有不少有機(jī)質(zhì)如氨基酸、B族維生素及某些植物激素[17－18]．因此，小球藻在沼液中實(shí)際上是一種混養(yǎng)生長．有研究表明，小球藻在混養(yǎng)條件下能夠比自養(yǎng)條件下積累更多的油脂[19]．潘欣等[20]對(duì)小球藻進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)小球藻脂肪含量有明顯上升，但蛋白含量有所下降．這與本文的研究結(jié)果相一致．利用沼液培養(yǎng)小球藻能夠顯著提升小球藻的脂肪含量，這對(duì)沼液的凈化及能源微藻[21]的開發(fā)具有重要意義．微藻的色素含量受光照、碳源、氮源、營養(yǎng)方式、金屬離子等多種因素影響[22－23]．通常情況下，小球藻在異養(yǎng)或混養(yǎng)條件下會(huì)出現(xiàn)葉綠素消失，細(xì)胞黃化等現(xiàn)象[24]．在本研究中，利用沼液培養(yǎng)的小球藻，其色素含量不但沒有減少，反而有明顯的增加．劉學(xué)銘等[25]和謝群等[26]分別利用谷氨酸和復(fù)合氨基酸對(duì)小球藻進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，谷氨酸和復(fù)合氨基酸對(duì)小球藻的色素含量的積累有明顯的促進(jìn)作用．鄭江等[27]研究谷氨酸鈉對(duì)鈍頂螺旋藻的生長及色素含量的影響，結(jié)果表明，低濃度的谷氨酸鈉能夠提高鈍頂螺旋藻的色素含量．因此，小球藻在沼液中培養(yǎng)，其色素含量升高可能與沼液中含有一定量的氨基酸有關(guān)．

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