紫菜多糖提取工藝技術(shù)及抗氧化活性研究

周小偉，鐘瑞敏

（韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005）

紫菜多糖提取工藝技術(shù)及抗氧化活性研究

周小偉，鐘瑞敏*

（韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005）

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響紫菜多糖提取得率的因素：提取溫度、提取時(shí)間、提取料液比設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：提取溫度為80℃、料液比為1∶20、提取時(shí)間為2 h，水提醇沉紫菜多糖得率最高。實(shí)驗(yàn)中利用Sevag法進(jìn)行脫蛋白，脫除6次后，蛋白含量從最開(kāi)始的14.31%降低至6.0%，多糖含量則可以達(dá)到87.66%。體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紫菜多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)·OH和DPPH·均有良好的清除效果，并呈現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系。其中當(dāng)濃度為3mg/mL時(shí)，·OH的清除率可以達(dá)到90.9%；當(dāng)濃度為2.5mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·清除率可以達(dá)到90%。

紫菜多糖；單因素；正交；抗氧化；紅外

多糖是廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中由單糖組成的天然高分子化合物。一般而言，根據(jù)來(lái)源不同，自然界中的多糖可分為動(dòng)物多糖、植物多糖以及微生物多糖[1]等。近年來(lái)，隨著多糖的各種功能如抗腫瘤、抗癌等開(kāi)始被研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)多糖進(jìn)行的研究也進(jìn)行得越來(lái)越頻繁。目前海洋功能性多糖的研究引起人們的高度關(guān)注。紫菜屬于海藻類(lèi)，主要為紅藻門(mén)紅毛菜科植物甘紫菜的葉狀體[2]，是一種深受人們喜愛(ài)的食物。紫菜多糖一般主要分為紫菜膠和瓊膠兩大類(lèi)，而二者的主要區(qū)別在于硫酸基含量的高低。

由于生長(zhǎng)條件、成長(zhǎng)環(huán)境等因素的影響[3]，紫菜多糖的含量會(huì)出現(xiàn)一定程度上的差異。并且各多糖組分中單糖組成也各有差異。研究證明，紫菜多糖主要由巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和木糖等組成，是一種糖醛酸含量較高的酸性雜多糖[4]。紫菜多糖的生物活性研究實(shí)驗(yàn)表明其具有多種生物學(xué)活性及藥用價(jià)值，如降血脂、抗血栓、降血糖抗炎、抗疲勞、增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用。因此在保健品和醫(yī)藥中具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。近年來(lái)，紫菜多糖因其來(lái)源廣泛，多糖含量高而引起研究者的興趣。但皆停留在初級(jí)提取階段，對(duì)其性質(zhì)，生物活性功能都缺少深入的研究。

本論文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以最大程度提高紫菜多糖的得率。同時(shí)，對(duì)脫蛋白后的紫菜多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫菜干：購(gòu)于南昌大學(xué)新世紀(jì)超市。

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市億通電子有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵；冷凍干燥機(jī)；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；B3200S-T超聲機(jī)：必能信超聲有限公司；T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；JY3001電子天平：上海衡平儀器儀表廠。

丙酮、無(wú)水乙醇、乙醚、正丁醇、氯仿、濃硫酸、苯酚、磷酸、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 原料的預(yù)處理[5]

干紫菜經(jīng)60℃干燥后粉碎，過(guò)80目篩子。后經(jīng)無(wú)水乙醇回流2 h，以除去其中所含的小分子色素及酯類(lèi)物質(zhì)等?；亓骱蟮姆勰┮来斡脽o(wú)水乙醇、丙酮和石油醚清洗后風(fēng)干得紫菜粗粉末。

1.2.2 紫菜多糖的提取方法[6]

稱(chēng)取一定質(zhì)量的經(jīng)過(guò)預(yù)處理的紫菜粉末，按照一定的料液比加入蒸餾水后，在一定溫度下水浴加熱一段時(shí)間。待提取液冷去后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至一定體積。靜置12 h、離心、冷凍干燥后得紫菜粗多糖。

1.3 不同提取條件對(duì)紫菜多糖提取率的影響

1.3.1 不同溫度對(duì)紫菜多糖提取率的影響

根據(jù)1.2.2所示的方法，分別稱(chēng)取5 g紫菜粉末，料液比為1∶20（g/mL），分別在65、70、75、80、85、90℃條件下，提取2 h，測(cè)定溫度對(duì)紫菜多糖得率的影響。

1.3.2 不同料液比對(duì)多糖得率的影響

分別稱(chēng)取5 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的紫菜粉末，控制提取溫度為80℃，在料液比（g/mL）分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40的條件下，提取2 h。測(cè)定料液比對(duì)紫菜多糖得率的影響。

1.3.3 不同料液比對(duì)紫菜多糖提取率的影響

分別稱(chēng)取5 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的紫菜粉末，控制料液比為1∶20（g/mL），提取溫度為80℃條件下分別提取1、1.5、2、2.5、3 h，測(cè)定提取時(shí)間對(duì)紫菜多糖得率的影響。

1.4 紫菜多糖的測(cè)定方法[7-9]

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中利用苯酚-硫酸[10]法測(cè)定紫菜粗多糖的含量以及純度，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

其中根據(jù)測(cè)定結(jié)果，紫菜多糖的得率用式（1）表示。

1.5 蛋白質(zhì)的去除

采用Sevag法脫蛋白，利用考馬斯亮藍(lán)法[11]測(cè)定蛋白含量。同時(shí)測(cè)定了脫除次數(shù)對(duì)紫菜多糖純度和含量的影響。

1.6 正交試驗(yàn)測(cè)定優(yōu)化測(cè)定紫菜多糖的提取條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取紫菜多糖各影響因素進(jìn)行優(yōu)化。因素水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素-水平表[12]Table 1 Factors and Levels of orthogonal experiment methodology

1.7 紫菜多糖的紅外光譜測(cè)定

取干燥的紫菜粗多糖1 mg～2 mg，研成粉末，與KBr混合壓片制樣，紅外光譜儀對(duì)樣品在400 cm-1～4 000 cm-1區(qū)內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.8 紫菜多糖的體外抗氧化活性研究

1.8.1 還原力的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)中以VC（抗壞血酸）為對(duì)照樣品[13]，不同質(zhì)量濃度的多糖樣品溶液作為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，取樣品溶液1 mL，加入2.5 mL的磷酸鹽緩沖液（pH=6.6），充分混勻后加入1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合均勻，后經(jīng)50℃恒溫水域加熱20 min。待溶液冷卻至室溫后加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL。離心后，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液。于700 nm處測(cè)定吸光度，吸光度越高，說(shuō)明這種反應(yīng)混合物的還原性越強(qiáng)。

1.8.2 清除·OH活性的測(cè)定

以不同溫度質(zhì)量濃度多糖樣品溶液為實(shí)驗(yàn)組[14]，VC作為對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中向1 mL樣品溶液中加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL，充分混勻后加入1mL濃度為6mmol/L的H2O2溶液，靜置10min。后加入6mmol/L水楊酸溶液1mL，于37℃水浴中反應(yīng)30min，反應(yīng)完全后在3 000 r/min，室溫下離心10 min。最后取上清液于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)其吸光度，空白對(duì)照以雙蒸水代替多糖溶液。

式中：SE代表清除率；Ai是樣品溶液的吸光度；Aj為雙蒸水代替水楊酸時(shí)樣品溶液的吸光度；A0為空白對(duì)照組吸光度。

1.8.3 DPPH自由基活性的測(cè)定根據(jù)AMAROWICZ[15]的方法測(cè)定。

式中：SE為清除率；Ai為2 mL DPPH溶液+2 mL樣品溶液吸光度；Aj為2 mL無(wú)水乙醇+2 mL樣品溶液吸光度；A0為2 mLDPPH溶液+2 mL雙蒸水吸光度。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

利用Origin 8.0作圖，Design Expert 7.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)紫菜多糖得率的影響

溫度對(duì)紫菜多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 溫度對(duì)紫菜多糖提取率的影響Fig.1 The effect of extraction temperature on the yield of of Porphyra Polysaccharide

從圖1可知，紫菜多糖的提取得率隨著溫度的升高先升后降。當(dāng)提取溫度為80℃時(shí)，得率最大。這可能是因?yàn)椋憾嗵堑奶崛∈且粋€(gè)持續(xù)溶出的過(guò)程，高溫有利于細(xì)胞破碎，多糖溶出，其得率上升；但當(dāng)溫度太高時(shí)，持續(xù)性的高溫提取會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)，多糖發(fā)生降解，得率下降。且在實(shí)際生產(chǎn)工作中，過(guò)高的溫度還會(huì)增加能耗和設(shè)備的投入。綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本等因素之后。本實(shí)驗(yàn)確定80℃為紫菜多糖的最佳提取溫度。

2.2 料液比對(duì)紫菜多糖得率的影響

料液比對(duì)紫菜多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

從圖2可知，隨著料液比的升高，多糖得率也會(huì)相應(yīng)的增高；而當(dāng)料液比過(guò)高時(shí)，多糖得率并未升高反而有所降低，可能是因?yàn)槎嗵悄芘c水以任意比互溶，水量越多，后續(xù)工藝中的提取液的濃縮成本和醇沉中的酒精用量就越多，提取液中多糖的濃度太低時(shí)，相同濃度的酒精就越難以將多糖沉淀出來(lái)。故在本實(shí)驗(yàn)中，選擇1∶20（g/mL）為最佳料液比。

圖2 料液比對(duì)紫菜多糖提取率的影響Fig.2 The effect of the ratio of raw materials to water on the yield of Porphyra Polysaccharide

2.3 提取時(shí)間對(duì)紫菜多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)紫菜多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)紫菜多糖提取率的影響Fig.3 The effect of extraction time on the yield of Porphyra Polysaccharide

從圖3可知，提取時(shí)間太短，不利于植物細(xì)胞的破碎，樣品中多糖未能充分溶出，從而降低多糖的提取率[16]；提取時(shí)間太長(zhǎng)，可能會(huì)使部分多糖在高溫提取過(guò)程中被破壞或者降解，降低多糖的得率，并且冷凍干燥后的粗多糖顏色較深，影響后期的溶解和吸光度的測(cè)定，造成浪費(fèi)資源，增加不必要的成本和能耗。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，綜合考慮成本和效率因素后，確定2 h為最佳提取時(shí)間，在此條件下紫菜多糖的得率為3.89%。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2可以看出，3個(gè)因素對(duì)最終粗多糖提取率的影響大小依次為提取溫度>料液比>提取時(shí)間，其中料液比對(duì)粗多糖得率的影響最為顯著。同時(shí)，正交的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳的提取條件為A3B2C2，即提取時(shí)間2 h，料液比為1∶20（g/mL），提取溫度80℃，在該條件下粗多糖的最終得率可以達(dá)到3.891 0%。

2.5 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，我們根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，以考察較優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件的再現(xiàn)性。準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g紫菜粉末，按比例加入100 mL的蒸餾水，80℃水浴浸提120 min，使其中的多糖溶解出來(lái)，后冷卻離心，收集上清液，定容至100 mL，利用苯酚-硫酸法顯色，測(cè)定其吸光度，并計(jì)算多糖含量及得率，結(jié)果顯示紫菜多糖得率可以達(dá)到3.95%?？梢宰C明在此條件下，紫菜多糖的得率最高。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal test

2.6 Sevag法脫除蛋白次數(shù)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)時(shí)，準(zhǔn)確稱(chēng)取適量紫菜粗多糖，溶解于適量超純水中，按樣品溶液體積的1/3～1/4加入Sevag試劑，攪拌均勻后置于離心機(jī)中離心15 min，轉(zhuǎn)速為6 500 r，后利用分液漏斗除去下層有機(jī)試劑以及中間層變性的蛋白質(zhì)，重復(fù)該操作6次，后收集上清液，濃縮后冷凍干燥，即可得到已脫蛋白的精制多糖。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 經(jīng)Sevag法脫蛋白的結(jié)果Table 3 The content of protein by Sevag reagent

利用Sevag試劑法除去粗多糖中的蛋白質(zhì)，主要是指除去游離蛋白質(zhì)。從上表結(jié)果可看出，經(jīng)過(guò)Sevag試劑法脫蛋白后，紫菜多糖中的蛋白質(zhì)降到6%左右，證明利用Sevag法可以較為徹底除去多糖中所含的蛋白質(zhì)。而剩下的蛋白則有可能與多糖結(jié)合在一起成為蛋白復(fù)合物。而實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)I-KI顯色實(shí)驗(yàn)測(cè)得反應(yīng)呈陰性，表明提取所得多糖中并不存在淀粉，是一種非淀粉類(lèi)多糖。

2.7 紫菜多糖的紅外光譜結(jié)果

紫菜多糖的紅外光譜結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 紫菜多糖的紅外光譜圖譜Fig.4 Infrared spectrums of Porphyra Polysaccharise

從提取的粗多糖的紅外光譜圖中我們可以看到，其具有一般多糖在紅外光譜中的特征性結(jié)構(gòu)，具有以下幾種特征峰[17]：3 442 cm-1的寬峰是多糖分子中-OH伸縮振動(dòng)峰；2 950處的是C-H的伸縮振動(dòng)峰，據(jù)此可以判斷該類(lèi)化合物是糖類(lèi)化合物。1 255 cm-1表明其可能存在著硫酸基；1 688 cm-1處的峰形表明其存在著C=O鍵，證明其可能存在著與多糖相結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)。

2.8 紫菜多糖的體外抗氧化性功能

2.8.1 還原力的測(cè)定

紫菜多糖還原力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 紫菜多糖的還原能力Fig.5 Reducing power of Porphyra polysaccharise

由圖5可以看出，紫菜多糖的還原能力有很好的量效關(guān)系，會(huì)隨著質(zhì)量濃度的增加呈上升趨勢(shì)。當(dāng)其濃度為4 mg/mL時(shí)，吸光度為0.69，證明其具有一定的還原能力。但是其還原力弱于VC。這可能因?yàn)樘崛〉降淖喜硕嗵蔷哂械倪€原性末端相對(duì)較少[18]。

2.8.2 紫菜多糖對(duì)·OH的清除能力的測(cè)定

紫菜多糖對(duì)·OH的清除能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6，可以看出，紫菜多糖對(duì)·OH的清除能力會(huì)隨著濃度的變化而隨之發(fā)生變化。當(dāng)濃度為3 mg/mL時(shí)，吸光度可以達(dá)到90.9%，與同等濃度的VC相接近。此外，提取到的紫菜多糖的清除·OH能力低于VC。這可能是因?yàn)椤H必須與多糖碳?xì)滏溕系臍湓咏Y(jié)合才能夠被清除，而VC由于有很強(qiáng)的還原性，不僅可以直接清除·OH，甚至可以抑制·OH的產(chǎn)生[19]。

2.8.3 紫菜多糖對(duì)DPPH·的清除能力

紫菜多糖對(duì)DPPH·的清除能力見(jiàn)圖7。

圖6 紫菜多糖清除·OH的能力Fig.6 Scavenging capacity of Porphyra polysaccharise on hydroxyl free radicals

圖7 紫菜多糖清除DPPH自由基能力Fig.7 Scavenging capacity of Porphyra polysaccharise against DPPH free radicals

根據(jù)圖可知，紫菜多糖對(duì)DPPH的清除具有很明顯的量效關(guān)系。隨著紫菜濃度的不斷增高，其對(duì)DPPH·的清除能力也不斷增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)甚至與VC相近，達(dá)到90%。

3 結(jié)論

1）本實(shí)驗(yàn)研究了紫菜中多糖的最佳提取方法。并且對(duì)影響其提取率的幾個(gè)主要因素分別進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果表明：最佳的提取溫度為80℃、料液比為1∶20、提取時(shí)間為2 h。在此條件下，其得率最高，可以達(dá)到3%。

2）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中利用Sevag法脫蛋白。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，脫蛋白6次時(shí)，多糖中蛋白含量最低，多糖含量最高，分別為6%和87%。

3）從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，紫菜多糖具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，且與其質(zhì)量濃度有著一定的關(guān)系。

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Study on Extraction of Porphyra Polysaccahride and its Antioxidant Properties

ZHOU Xiao-wei，ZHONG Rui-min*
（Yingdong College of Food Science and Technology，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China）

On the base of single factor including extraction temperature，extraction time and the ratio of raw materials to water，experiments，the research aims to explore the suitable consideration considering the optimal conditions of extracting porphyra polysaccharide.According to the experiments，the optimal conditions for extracting porphyra polysaccharide can be as follows：extraction temperature 80℃，extraction time 2 h，the ratio of raw materials to water was 1∶20.Following this，the yield of porphyra polysaccharide could be 3%.On the next stage，Sevag has been employed to remove the obtained protein.After six times，the content of protein can be reduced from 14.31%to 6.0%whilst the content of porphyra polysaccharide can reach 87.66%.The result of antioxidant activity revealed that the extract showed good scavenging effect for·OH and DPPH·.Besides，there were obvious positive relationship between the concentration and activity of the extract.When the concentration of porphyra polysaccharide was 3 mg/mL，·OH scavenging rate can reach 90.9%；and when the concentration of porphyra polysaccharide was 2.5 mg/mL，DPPH·scavenging rate can reach 90%.

porphyra polysaccharide；single factor；orthogonal test；antioxidant property；IR

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.012

2014-06-24

周小偉（1986—），男（漢），助教，碩士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)。

*通信作者：鐘瑞敏，男，教授，博士，研究方向：食品中天然產(chǎn)物及工藝研究。