兩種線栓制備法制作大鼠大腦中動脈阻塞再灌注損傷模型的研究

田瑩，劉藝，余化霖

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院護理部1、神經(jīng)外科二科2，云南昆明 650032)

·論著·

兩種線栓制備法制作大鼠大腦中動脈阻塞再灌注損傷模型的研究

田瑩1，劉藝2，余化霖2

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院護理部1、神經(jīng)外科二科2，云南昆明 650032)

目的評價兩種制備線栓的方法，為腦缺血實驗研究提供穩(wěn)定可靠的動物模型。方法30只SD雄性大鼠(250～280 g)隨機分成兩組各15只，第一組采用Zea Longa流派(線栓頭端加熱成球形)，第二組采用Koizumi流派(線栓頭端用膠包裹)，兩種線栓制備法分別制作大鼠大腦中動脈阻塞再灌注損傷模型，觀察手術(shù)時間、神經(jīng)功能評分，計算梗死百分比，并分析神經(jīng)功能評分和腦梗死體積比之間的關(guān)系，對兩種線栓制備法模型的成功率與穩(wěn)定性進行評價。結(jié)果兩組在神經(jīng)功能評分、腦梗死體積比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；兩組模型的穩(wěn)定性相近；神經(jīng)功能評分與腦梗死體積比之間存在相同變化趨勢；第二組操作時間少于第一組，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論第二組的線栓制備法線栓頭采用密封膠包裹，線栓頭大小容易控制，較第一組線栓頭端加熱成球形所需時間短，且易操作。

中動脈阻塞再灌注；模型；線栓法；大鼠

隨著當(dāng)今社會的老齡化，腦血管的發(fā)病率日益增加，大鼠大腦中動脈阻塞再灌注損傷模型(MCAO/R)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于急性局灶性腦梗死的研究。在整個模型制作過程中，線栓的制作尤為重要。目前對線栓的材質(zhì)及其制備并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，本研究旨在尋找合適可用、操作性重復(fù)性強的線栓并將其與傳統(tǒng)線栓做對比研究，探索簡便易行、穩(wěn)定性好的建模方法，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物成年雄性SD(Sprague-Dewley)大鼠30只，體重250～280 g，由昆明醫(yī)學(xué)院動物研究中心提供，飼養(yǎng)溫度18℃～22℃，隨機分成兩組，每組15只。

1.2 材料“極波”牌漁線(興化市漁樂漁具廠)、快干型防霉硅酮密封膠、10%水合氯醛、2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)、10%多聚甲醛等；生理鹽水配制2%的TTC染色，染液，避光保存。

1.3 模型制作

1.3.1 動物的處理及線栓的制備參照Longa等[1]和羅勇等[2]報道的方法，采用經(jīng)頸內(nèi)動脈線栓法制備大鼠右側(cè)MCAO致局灶性腦缺血再灌注模型。30只SD大鼠隨機分成兩組，第一組采用Zea Longa等[3]流派傳統(tǒng)的制作線栓法，在線栓前端加熱燙成一光滑而膨大的球形術(shù)中使用；第二組采用Koizumi等[4]流派的方法，在線栓頭端用快干型密封膠包裹形成類梭形術(shù)中使用。兩組均選用直徑0.23～0.26 mm漁線。每組保證15只完成。

1.3.2 手術(shù)步驟大鼠經(jīng)10%水合氯醛4 ml/kg腹腔內(nèi)麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺上，取頸部旁正中切口3～5 cm，剪開皮膚，逐層鈍性分離皮下組織及筋膜，見到頸總動脈(Common carotid artery，CCA)鞘后充分暴露術(shù)野；將CCA、頸內(nèi)動脈(Internal carotid artery，ICA)、頸外動脈(External carotid artery，ECA)及相鄰神經(jīng)分離出來后盡量把ICA入顱前唯一的分支——翼腭動脈(Pterygopalatine artery，PPA)分離露出根部，在ECA近CCA分叉處將其結(jié)扎，CCA近心端也結(jié)扎，此結(jié)扎處與CCA分叉間備線。微型血管夾暫時夾閉ICA，在CCA結(jié)扎處與備線處間斜行剪一小口，眼科鑷挑起破口后插入線栓。插線前可將線栓制成微向上向右的弧形以順應(yīng)血管的生理彎曲，進線深度至CCA分叉處1.8～2.0 cm時線栓進入大腦前動脈(Anterior cerebral artery，ACA)并堵住大腦中動脈(Middle cerebral artery，MCA)入口，阻斷了同側(cè)ICA和經(jīng)ACA來自對側(cè)ICA的血供，結(jié)扎備線略作固定，依次縫合皮肌各層，栓線外留1 cm有顏色標(biāo)記的尾端，上述過程一般30～40 min。記錄穿線成功的時間點(不包括縫皮的時間)，術(shù)后回籠，單籠飼養(yǎng)，籠內(nèi)保暖。

1.3.3 再灌注栓線植入2 h后再次麻醉，由露出皮膚的栓線尾部將栓線緩緩抽出，當(dāng)栓線球面前端遇到CCA結(jié)扎線時感覺有阻力，即停止拔線，剪除栓線的殘余末端，大鼠清醒后可自由進食、進水。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)功能評分神經(jīng)行為功能測試：評分參照Bederson等[5]、Zea longa等[3]的五級4分評分方法并改進。0分(0級)：未見神經(jīng)病學(xué)征象；1分(Ⅰ級)：輕微的神經(jīng)功能缺損；2分(Ⅱ級)：中度局灶性神經(jīng)功能缺損；3分(Ⅲ級)：重度局灶性神經(jīng)功能缺損；4分(Ⅳ級)：無自發(fā)活動及意識水平下降。0級、Ⅳ級為模型失敗，Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級為模型成功，以Ⅱ級、Ⅲ級占成功模型的百分率來評價模型穩(wěn)定性[6]。待麻醉醒后2 h進行第一次神經(jīng)功能評分，再灌注6 h、24 h分別再進行兩次神經(jīng)功能評分。

1.4.2 腦梗死體積測定大鼠缺血再灌注24 h候麻醉后處死取腦，-20℃冰箱中速凍20 min。在冰盤上取前腦切片，切四刀，成5～6片腦片，每片厚約2 mm，由額級開始從前至后依次排序。切片置于2% TTC中，放入37℃溫箱15～30 min，翻動腦片染色，腦片中正常組織為紅色，梗死組織為白色。30 min后將腦片移出置入10%多聚甲醛溶液中，4℃冰箱固定24 h。腦片固定后用數(shù)碼相機照相，輸入計算機，經(jīng)電腦圖像分析量化腦梗死絕對體積占對側(cè)大腦半球體積的百分比，用梗死率(Infarction ratio)表示梗死灶的大小，將所得值用于統(tǒng)計學(xué)處理。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法收集整理實驗組數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件包進行處理；各組均數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間差異用獨立樣本t檢驗或方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，組內(nèi)比較用變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)評估第一組動物模型制作手術(shù)操作時間為(39.4±5.50)min；第二組為(30.30±9.28)min。實驗結(jié)果表明，第二組操作時間少于第一組，與第一組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；動物模型制作成功率第一組(60%)與第二組(73%)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 動物模型的神經(jīng)功能評分比較采用Wilcoxon秩和檢驗分析，結(jié)果顯示大鼠模型在麻醉后2 h、再灌注6 h、再灌注24 h三個時間點的神經(jīng)行為功能評分在第一組和第二組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組動物模型神經(jīng)功能評分(±s，分)

表1 兩組動物模型神經(jīng)功能評分(±s，分)

組別第一組第二組Z值P值麻醉后2 h 1.00±4.00 4.00±1.00 -0.682 0.495再灌注6 h 0.73±0.88 3.00±1.00 -0.938 0.348再灌注24 h 1.00±1.00 2.00±2.00 -0.910 0.363

2.3 動物模型穩(wěn)定性比較第一組動物模型神經(jīng)行為功能評分測試Ⅱ～Ⅲ級5例，其他級別10例，計算此組模型穩(wěn)定性為33.3%；第二組測試Ⅱ～Ⅲ級8例，其他級別8例，此組模型穩(wěn)定性為53.3%。經(jīng)過χ2檢驗結(jié)果顯示，第一組和第二組模型制作成功穩(wěn)定性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 腦梗死體積測定根據(jù)照片分組計算兩組30只大鼠全部鼠腦標(biāo)本不同片層的每片腦片的梗死體積比，梗死面積比=梗死面積/總面積。分組計算兩組30只大鼠全部鼠腦標(biāo)本不同片層的腦片的平均梗死面積比值(圖1)。第一組動物模型15只大鼠腦梗死體積比為(21.89±0.71)%，第二組大鼠腦梗死體積比為(22.75±3.32)%，采用Wilcoxon秩和檢驗分析，結(jié)果顯示第一組和第二組腦梗死體積比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠神經(jīng)功能缺失評分高低與腦梗死體積比的大小呈相同變化趨勢，神經(jīng)功能缺失評分高的大鼠，其腦梗死體積比也大。

圖1 兩組大鼠腦梗死體積比比較

3 討論

3.1 大鼠體重與栓線直徑、栓線頭直徑有學(xué)者認為大鼠體重越重，插線直徑越大[7]，本實驗選擇大鼠體重為250～280 g，筆者認為該體重的大鼠，血管變異性小，生命耐受力強，易于控制實驗條件；線栓直徑選擇為0.23～0.26 mm的線栓，栓線過粗不能進入顱內(nèi)，過細在顱內(nèi)插入太深，會導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)大鼠死亡。根據(jù)本實驗大鼠體重，我們制作線栓頭直徑應(yīng)用的兩種方法直徑均控制在0.28～0.30 mm。此外要注意拴線的質(zhì)量，一些質(zhì)地腳軟的線不宜選擇，否則增加插線難度，質(zhì)地太硬易造成血管損傷。

3.2 線栓頭及線栓的處理在模型制作過程中，對線栓頭端的處理是為了讓阻斷更加徹底、可靠，同時減少對血管壁的機械性損傷。線栓頭端光滑與否對其插入是否順暢及造成的缺血性損傷的穩(wěn)定性有較大影響，本實驗第一組在線栓前端加熱燙成一光滑而膨大的球形；第二組在線栓頭端用快干型密封膠包裹形成類梭形。兩組線栓頭制作均嚴(yán)格要求光滑度，并對線栓頭直徑作了嚴(yán)格要求，處理均按上述要求完成。值得一提的是，第二組用密封膠涂覆梭形頭線栓的制備方法，制作簡便，涂敷效果理想，密封膠化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不刺激血管，不與血液成分發(fā)生反應(yīng)，處理后的線栓頭端圓頓，不易損傷血管壁，在推送栓線過程中更為順暢，實驗結(jié)果表明，第二組操作時間少于第一組，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。第二組較第一組易操作，線栓頭端大小更易控制。

3.3 栓線插入深度插入過程中，強調(diào)遇到阻力即止，插入過深或用力過猛易損傷大腦中動脈環(huán)造成SAH，過短則不能阻斷血流。線栓法制作大鼠MCAO模型的插線深度在1.65～2.00 cm是有效安全范圍。本實驗根據(jù)大鼠體重，我們的體會是進線深度至頸總動脈分叉處足1.8～2.0 cm時線栓已進入大腦前動脈并堵住大腦中動脈入口。

3.4 栓線殘端的處理目前關(guān)于栓線殘端的處理，文獻報道的很少，在試驗中我們體會到這也是影響結(jié)果的重要因素之一。孔衛(wèi)國等[8]認為如栓線殘端留在體外過長，大鼠清醒后會自己將栓線拔出，造成提前灌注；如過短，拴線會縮回肌肉內(nèi)，而大鼠清醒后頭部的活動已造成栓線殘端在體內(nèi)彎曲，有一定張力，容易刺破血管。本實驗我們采用栓線外留1 cm有顏色標(biāo)記的殘端，在拔栓線時容易尋找，且長短合適，未發(fā)生上述報道情況。

3.5 并發(fā)癥蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)為該模型最常見的并發(fā)癥，本研究據(jù)估計至少3只大鼠死于SAH；手術(shù)過程中插線可以引起血管內(nèi)皮的損害從而導(dǎo)致血栓形成，為避免血栓形成，本實驗使用肝素處理栓線；在插線過程中應(yīng)盡量保持栓線與血管方向最大一致性，動作輕柔，栓線及頭端平整圓滑，也可以預(yù)防血栓形成；此外我們在麻醉前使用少量阿托品能有效預(yù)防動物呼吸道分泌物增多引起的窒息。

3.6 腦梗死面積本實驗?zāi)X梗死灶主要位于紋狀體和皮質(zhì)，呈蒼白色，未缺血部分呈紅色，說明模型制作成功。參考大鼠腦圖譜，MCAO大鼠缺血部位位于尾狀核、蒼白球、內(nèi)囊后肢、顳及額葉皮層、部分下丘腦和丘腦；根據(jù)TTC染色和圖像分析處理后，對不同梗死腦片參考大鼠腦圖譜進行了組織功能學(xué)定位得出了大鼠MCAO手術(shù)后在不同片層的梗死面積比值。結(jié)果表明，采用不同線栓頭制備MACO大鼠模型，計算腦梗死體積密封膠涂覆線栓頭組比傳統(tǒng)加熱球形頭線栓組測得相對腦梗死體積稍有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

綜上所述，本實驗對采取兩種線栓頭處理的線栓法制備大鼠MCAO/R模型，術(shù)中對大鼠體重及線栓的處理、線栓直徑、插入深度等影響建模的因素進行了嚴(yán)格控制，模型制作取得預(yù)期效果；模型制作在神經(jīng)功能評分方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，兩組的模型成功率及穩(wěn)定性相近；模型制作手術(shù)操作時間有差異，第二組模型制作操作時間少于第一組，第二組較第一組易操作，涂敷效果理想，線栓頭端大小更易控制；大鼠神經(jīng)功能缺失評分高低與腦梗死體積比的大小呈相同變化趨勢，神經(jīng)功能缺失評分高的大鼠，其腦梗死體積比也大。用密封膠涂覆過的線栓與傳統(tǒng)制作方法相比，造成的缺血再灌注模型也同樣可靠。

[1]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et a1.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Jap stroke, 1989,20(1):84.

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[3]Zea Longa E,Weinstein PR,CarisonS,et a1.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 1989,(20):84-91.

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Study on twoMethodsof making suture-embolus for the model of middle cerebral artery occlusion reperfusion in rats.

TIAN Ying1,LIU Yi2,YU Hua-lin2.Department of Nursing1,the Second Department of neurosurgery2,the First Affiliated Hospital of Kunming Medial University,Kunming 650032,Yunnan,CHINA

ObjectiveTo evaluate the effect of twoMethodsof making suture-embolus,and to provide more stable and reliable animal models for experimental study of cerebral ischemia.MethodsThirty male Sprague-Dawley(SD)rats(250～280 g)were randomly divided into two groups,with 15 rats in each group.The rats of group one were subjected to temporary MCAO/R by using the method of Zea Longa(the tip of suture-embolus be heated to round),and those of group two were subjected to Koizumi(the tip of suture-embolus be wrapped by sealant).By recording the time of making MCAO/R model,the grade of neurobehavioral function of rats,calculating the infarct volume ratios and analyzing the relationship between the latter two,the success ratio and stability of twoMethodsof making suture-embolus were evaluated.ResultsThere was no significant difference on the evaluation of neurobehavioral function and on the volume ratios of brain infarction.The stability of the two models was similar.There was the same trend between the neurobehavioral function and the volume of brain infarction.The operate time of group two is shorter than group one.The difference between two groups has statistical significance(P＜0.01).ConclusionThe method for group two(the tip of suture-embolus can be wrapped by sealant,and its size can be controlled more easily)is easier to operate and need shorter time than the method for group one(the tip of suture-embolus be heated to round).

Middle cerebral artery occlusion reperfusion;Model;Suture-embolus method;Rat

R-332

A

1003—6350（2014）03—0320—03

2013-06-07)

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.03.0125

云南省高層次衛(wèi)生技術(shù)人才學(xué)科帶頭人項目(編號：D201246)

劉藝。E-mail：chowputty@sohu.com