一株豬源致病性蠟樣芽孢桿菌的分離與鑒定

趙振宇，戴榮四，劉東友，鄧治邦，李潤成，尹崇*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；b.動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.澳大利亞皇家病理學(xué)院質(zhì)保所，新南威爾士 2052)

一株豬源致病性蠟樣芽孢桿菌的分離與鑒定

趙振宇1a，戴榮四1a，劉東友2，鄧治邦1b，李潤成1b，尹崇1b*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；b.動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.澳大利亞皇家病理學(xué)院質(zhì)保所，新南威爾士 2052)

無菌采集流行性腹瀉耐過仔豬的肝臟樣本，經(jīng)無氧及有氧培養(yǎng)獲得一株疑似蠟樣芽孢桿菌的純培養(yǎng)物，命名為HN1203。16SrDNA序列(GenBank登錄號為JX294967)分析表明，HN1203為蠟樣芽孢桿菌群第7基因型菌株。生化鑒定結(jié)果表明，該菌的生化特性符合蠟樣芽孢桿菌群成員的特征。藥敏試驗和伴孢晶體蛋白檢測結(jié)果表明，該菌對鏈霉素和四環(huán)素敏感，對青霉素不敏感，其芽孢不形成伴孢晶體。多位點序列分型(MLST)檢測結(jié)果表明，該菌帶有蠟樣芽孢桿菌看家基因pta新的等位基因pta153，序列基因型為ST611。毒素基因的PCR檢測結(jié)果表明，該菌攜帶腸毒素基因(hbl、nhe和entFM)和細(xì)胞毒素K基因(cytK)。綜合以上結(jié)果，分離菌為一株新的蠟樣芽孢桿菌，且提示分離培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌時，不宜采用常用的有氧條件。進一步動物試驗結(jié)果表明，該分離菌株能夠致死實驗小白鼠。提示生產(chǎn)實踐中應(yīng)該重視監(jiān)控豬源致病性蠟樣芽孢桿菌的潛在危害。

仔豬；蠟樣芽孢桿菌；流行性腹瀉；分離；鑒定

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是一種廣泛分布 于土壤、水、空氣、植物、飼料和各類食品的兼性厭氧、產(chǎn)芽孢桿菌[1]。根據(jù)全基因信息，蠟樣芽孢桿菌與昆蟲病原菌蘇云金桿菌(B. thuringiensis)和人畜病原菌炭疽芽孢桿菌(B. anthracis)同屬于蠟樣芽孢桿菌群[2]。蠟樣芽孢桿菌與蘇云金桿菌的區(qū)別在于蘇云金桿菌的芽孢攜帶具有殺蟲作用的伴孢晶體蛋白；與炭疽桿菌的區(qū)別在于炭疽桿菌對青霉素敏感、需氧生長并產(chǎn)生炭疽毒素[2]。

有的蠟樣芽孢桿菌菌株可用作益生菌添加到食品和飼料中；有的菌株則為條件致病菌，容易污染食物，引起人畜腸道疾病，甚至嚴(yán)重的系統(tǒng)性感染，也是引起牛乳房炎，子宮內(nèi)膜炎的常見病原菌[3–4]，但還未見豬感染該菌的報道。

2012年3月，湖南懷化某豬場爆發(fā)哺乳仔豬腹瀉，仔豬在出生后3 d發(fā)病，死亡集中在發(fā)病后1星期內(nèi)，死亡率60%以上。有實驗室診斷為冠狀病毒引起的仔豬流行性腹瀉病(PED)。耐過仔豬生長不良、消瘦，剖檢可見腹腔充滿淡黃色的清亮腹水，肝、肺和脾臟等器官被白色纖維素膜覆蓋，因而懷疑耐過仔豬可能有細(xì)菌繼發(fā)感染，送湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物實驗室進行細(xì)菌學(xué)診斷。采取發(fā)病仔豬肝臟樣品進行檢查，結(jié)果分離出一株兼性厭氧芽孢桿菌，經(jīng)過細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，以及動物致病性試驗，確定為一株新的致病性蠟樣芽孢桿菌。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌的分離

從湖南懷化某爆發(fā)哺乳仔豬腹瀉的豬場無菌采集一例斷奶2周的腹瀉耐過仔豬的肝臟組織，分別接種到 GAM肉湯培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)，5%血清肉湯培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基和巧克力瓊脂培養(yǎng)基[5–6]，于37 ℃同時進行需氧和厭氧培養(yǎng)48 h，結(jié)果僅從GAM肉湯培養(yǎng)基中分離到芽孢桿菌。對分離菌用以上4種培養(yǎng)基進行需氧及厭氧培養(yǎng)，以進一步分離純化細(xì)菌及革蘭氏染色鏡檢[5–6]。在顯微鏡下觀察細(xì)菌的運動性，具體方法為：取生長24 h菌懸液滴于載玻片，加蓋玻片后進行觀察。

1.2 引 物

檢測細(xì)菌16S rDNA，溶血型腸毒素基因(hbl)、非溶血型腸毒素基因(nhe)、腸毒素 FM 基因(entFM)、細(xì)胞毒素 K基因(cytK)的引物見表 1。7個看家基因(glpF，gmk，ilvD，pta，pur，pycA，tpi)的多位點序列分型(MLST)檢測引物見網(wǎng)址 http:// pubmlst.org/bcereus。以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 16SrDNA及毒素基因PCR擴增引物Table 1 Primers used for amplifying 16SrDNA and toxigenic genes

1.3 16S rDNA的檢測

提取分離到的芽孢桿菌第一代細(xì)菌純培養(yǎng)物的DNA[9]，作為模板，用引物對8F和1542R進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。測序結(jié)果提交GenBank，并與其他芽孢桿菌成員進行比對，確定16S基因型[7]。

1.4 生化鑒定

按傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法[5–6]，將獲得的分離菌株接種各種糖發(fā)酵培養(yǎng)基進行糖發(fā)酵試驗，同時進行吲哚試驗、甲基紅試驗、VP試驗、觸酶試驗、硫化氫試驗，觀察生化反應(yīng)特性。

1.5 藥敏試驗

采用藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)法檢測分離菌株的藥物敏感性。

1.6 伴孢晶體蛋白檢測

將分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基[5–6]上 37 ℃培養(yǎng)72 h，待芽孢形成后，用考馬斯亮藍(lán)染色，在普通顯微鏡下檢測是否有伴孢晶體蛋白。

1.7 MLST分析

按照 1.3的方法制備分離菌株的 DNA。用MLST引物進行PCR檢測。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/bcereus)相應(yīng)基因比對，確定基因型。如果有新的等位基因則向該網(wǎng)站提供原始測序數(shù)據(jù)，由網(wǎng)站指定分離菌的基因型。

1.8 毒素基因的PCR檢測

按照1.3的方法制備分離菌株的DNA。用毒素基因的特異性引物(表1)進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段長度。

1.9 動物試驗

將分離菌接種在GAM肉湯培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h，應(yīng)用平板活菌計數(shù)法和濕重法相結(jié)合計數(shù)。致病性試驗選用4周齡雌性健康昆明小白鼠(購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)，設(shè)3個組：對照組、正常試驗組和抑制組。對照組8只小鼠，正常試驗組和抑制組均分6個小組，每個小組8只小鼠。對照組的小鼠腹腔注射生理鹽水，0.2 mL/只；正常試驗組6組小鼠分別腹腔注射104、105、106、107、108、109CFU/mL的蠟樣芽孢桿菌，0.2 mL/只；抑制組小鼠的注射方式同正常試驗組，抑制組小鼠在細(xì)菌接種前4 d腹腔注射環(huán)磷酰胺(0.25 g/kg)以降低機體免疫能力。接種后每天觀察記錄小白鼠發(fā)病死亡情況，并于接種后第7天捕殺4只未死亡小鼠，第 15天捕殺未死亡全部小鼠，用心血和肝臟接種普通肉湯和普通瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)后進行細(xì)菌革蘭氏染色鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特征

在無菌采集的肝臟樣品所接種的 4種培養(yǎng)基中，只有GAM肉湯厭氧條件培養(yǎng)48 h時有細(xì)菌生長，該菌的繼代培養(yǎng)能夠適應(yīng)有氧條件，并在 5%血清肉湯培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基和巧克力瓊脂培養(yǎng)基生長良好(圖1–A)，37 ℃培養(yǎng)8 h，即可形成圓形光滑菌落，24 h形成5～8 mm邊沿不整齊的大型菌落，細(xì)菌水浸片在顯微鏡下可見細(xì)菌活躍運動；在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上呈明顯β型溶血；培養(yǎng)特性初步表明分離菌株為蠟樣芽孢桿菌群細(xì)菌，命名為HN1203。革蘭氏染色呈陽性，可形成芽孢(圖1–B)。

圖1 分離菌株的生長狀態(tài)和在顯微鏡下的形態(tài)Fig. 1 Growth state of the isolated strain and its morphology under microscope

2.2 細(xì)菌16SrDNA分析

蠟樣芽孢桿菌群成員有13個基因型[7]，根據(jù)16SrDNA序列差異性分析，確定 HN1203菌株16SrDNA序列(GenBank登錄號為 JX294967)為蠟樣芽孢桿菌群第7基因型。這一基因型同時包含蠟樣芽孢桿菌和炭疽桿菌(好氧菌，對青霉素敏感)的菌株。蘇云金桿菌另包含于基因型3和11。初步確定該分離菌株為蠟樣芽孢桿菌或炭疽桿菌。

2.3 生化特性

生化試驗發(fā)現(xiàn)，HN1203菌株能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，不發(fā)酵乳糖、木糖、甘露醇和果膠糖。過氧化氫酶試驗、甲基紅試驗(M.R.)和乙酰甲基甲醇試驗(V–P)為陽性，吲哚試驗和硫化氫試驗為陰性。分離菌的這些生化特性符合蠟樣芽孢桿菌

群成員的特征。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果顯示，HN1203菌株對鏈霉素和四環(huán)素敏感，對青霉素不敏感，再加上兼性厭氧的特點，表明該菌為蠟樣芽孢桿菌，排除了該菌為炭疽桿菌的可能性。

2.5 伴孢晶體檢測結(jié)果

伴孢晶體檢測結(jié)果顯示，HN1203在形成芽孢后不形成伴孢晶體，進一步證明該菌為蠟樣芽孢桿菌，而非蘇云金桿菌。

2.6 MLST分析

MLST分析顯示，分離菌7個看家基因中有6個為已有等位基因，其中pta為新的等位基因，提交測序原始數(shù)據(jù)后被指定為pta153。分離菌株被指定為基因型ST611(http://pubmlst.org/bcereus)，確定HN1203菌株為蠟樣芽孢桿菌新菌株。利用該網(wǎng)站提供的工具繪制基因型進化樹(圖2)。結(jié)果顯示分離菌與引起人嚴(yán)重腸道疾病的蠟樣芽孢桿菌致病性菌株ST91、ST140和ST141[10]具有高度同源性。

圖2 菌株HN1203與其他蠟樣芽孢桿菌的進化樹Fig.2 Phylogenetic tr ee of B. c ereus HN1203 an d ot her Bacillus spp.

2.7 毒素基因的PCR檢測結(jié)果

與蠟樣芽孢桿菌致病性相關(guān)的毒素中，溶血性腸毒素(HBL)和非溶血性腸毒素(NHE)都是由 3個亞基構(gòu)成的復(fù)合蛋白，腸毒素(entFM)和細(xì)胞毒素K(cytK)為單體蛋白。Ngamwongsatit等[8]用PCR檢測了612株細(xì)菌，他們設(shè)計的引物能夠同時檢測到編碼這些毒素的基因hblC、D、A，nheA、B、C、entFM和cytK。但是，本研究引用該方法不能檢測到HN1203的毒素亞基基因hblD 和 nheA，而這2個亞基可以用另一發(fā)表的 hblD、nheA[9](表 1)檢測得到(圖3)，說明HN1203菌株的腸毒素是由不同等位基因編碼的亞基經(jīng)過特異性重組而成。

圖3 分離菌HN1203毒素基因的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig. 3 Electrophoresis of PCR products of virulence genes in B. cereus HN1203

2.8 動物試驗結(jié)果

對照組的小白鼠在試驗期內(nèi)一直未發(fā)病，并且心血和肝組織均檢測不到細(xì)菌。抑制組和正常試驗組的小白鼠的菌檢結(jié)果及死亡情況見表 2。腹腔注射107～109CFU/mL 蠟樣芽孢桿菌HN1203的抑制組小白鼠全部在36 h內(nèi)出現(xiàn)腹瀉，隨后全部死亡；腹腔注射104～106CFU/mL HN1203的抑制組小白鼠在試驗期內(nèi)沒有死亡。正常試驗組小白鼠中，只有腹腔注射109CFU/mL 蠟樣芽孢桿菌HN1203的小白鼠在36 h內(nèi)出現(xiàn)腹瀉，隨后死亡，其他注射劑量的小白鼠在試驗期內(nèi)沒有死亡。第7天捕殺抑制組和正常試驗組的小白鼠各4只，從心血及肝臟內(nèi)分離到蠟樣芽孢桿菌，顯示該細(xì)菌在動物體內(nèi)呈敗血癥感染，第15天捕殺各組剩余的4只小白鼠，只有注射105和104CFU/mL HN1203的正常試驗組小白鼠的肝臟和心血中分離不到接種的細(xì)菌，而其他正常試驗組和抑制組的小白鼠均能分離到接種菌。注射環(huán)磷酰胺時，各組小鼠平均體重為18.5 g/只，4 d后接種細(xì)菌時，抑制組平均體重沒有明顯增加，平均體重為18.6 g/只，其他各組平均體重已經(jīng)達到20 g/只。通過動物試驗，說明蠟樣芽孢桿菌HN1203具有致病性，且對免疫機能損傷的動物有更強的感染性，提示流行性腹瀉耐過仔豬，因免疫能力下降，繼發(fā)感染了蠟樣芽孢桿菌。

表2 小白鼠腹腔接種蠟樣芽胞桿菌HN1203檢測結(jié)果Table 2 Results of mice inoculation test with Bacillus cereus HN1203

3 討 論

a. 通過常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法和分子生物學(xué)方法的檢測，本研究從仔豬流行性腹瀉耐過仔豬肝臟分離到一株新的蠟樣芽孢桿菌，命名為HN1203。

b. 用病豬肝臟樣品進行細(xì)菌分離培養(yǎng)時，除GAM 厭氧肉湯以外，其他培養(yǎng)基未見該菌生長，而分離菌繼代培養(yǎng)時該菌對有氧條件的適應(yīng)表明該菌具有兼性厭氧特征，同時也說明從流行性腹瀉耐過病豬實質(zhì)器官分離培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌時，不宜采用常用的有氧條件，這也可能是一直未見豬感染蠟樣芽孢桿菌的報道的原因之一。從HN1203體外第一代GAM厭氧肉湯培養(yǎng)物提取的DNA能夠作為PCR模板，用來檢測16SrDNA序列和進行MLST分析，說明肝臟樣品不經(jīng)分離培養(yǎng)即可獲得該菌的純培養(yǎng)物。另外，由于該菌具有潛在的病原性，可能是本例流行性腹瀉耐過病豬生長不良和消瘦的重要原因。HN1203與人病原性菌株[11]高度同源，含有多種毒素基因，以及能夠致死試驗動物，均證實了該分離菌株的病原性的存在。

c.豬源性蠟樣芽孢桿菌致病菌株 HN1203的分離鑒定，提示人們應(yīng)該重視豬源致病性蠟樣芽孢桿菌的潛在危害，加強蠟樣芽孢桿菌用作益生菌時的安全性檢測，以及有必要進行豬群中病原性蠟樣芽孢桿菌的流行病學(xué)調(diào)查和豬肉相關(guān)食品衛(wèi)生檢測。

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責(zé)任編輯：羅 維

英文編輯：羅 維

Isolation and characterization of a pathogenic Bacillus cereus from a piglet with diarrhea

ZHAO Zhen-yu1a，DAI Rong-si1a，LIU Dong-you2，DENG Zhi-bang1b，LI Run-cheng1b，YIN Chong1b*
(1.a.College of Animal Science and Technology; b.College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Royal College of Pathologists of Australasia Quality Assurance Programs, New South Wales 2052, Australia)

Through aerobic and anaerobic cultivation, pure culture of a bacterial strain named HN1203 suspected to be Bacillus cereus (B. cereus) was isolated from liver sample of a piglet recovered from severe post-wean diarrhea syndrome. Analyzing of 16S rRNA sequence (GenBank accession number JX294967) of HN1203 showed this strain belongs to type 7 of Bacillus cereus group. Biochemical identification indicated biochemical characteristics of HN1203 are accord with that of the strains of B. cereus group. Drug susceptibility testing and parasporal crystal protein test showed that this strain was sensitive to tetracycline and streptomycin, resistant to penicillin, and no parasporal crystal was formed on the spore of HN1203. Multilocus sequence typing (MLST) assays revealed a new allele of house-keeping gene pta, which was assigned a new sequence type (ST) of 611. PCR detection showed HN1203 harbors virulence-coding genes hblCDA, nheABC, cytK and entFM. These results showed HN1203 is a now B. cereus strain, and isolation of which indicated that normally used aerobic condition is not suitable for isolation of B. cereus. Further animal test showed HN1203 could be fatal to mice. These findings highlight the need of increased awareness of pathogenic B. cereus in pig and its zoonotic potential.

piglet; Bacillus cereus; epidemic diarrhea; isolation; characterization

10.13331/j.cnki.jhau.2014.03.017

S852.61+6

A

1007?1032(2014)03?0311?05

2014–02–13

國家自然科學(xué)基金項目(C050103)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)人才科學(xué)基金項目(07WD05；09WD06)

趙振宇(1989—)，女，湖南澧縣人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動物醫(yī)學(xué)研究，460593498@qq.com；*通信作者，chongy@ hunau.edu.cn

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks