魔芋內(nèi)生拮抗細(xì)菌生防機(jī)理研究

周麗洪，姬廣海*，王永吉，李淼，楊俊，魏蘭芳

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.植物保護(hù)學(xué)院；b.農(nóng)科基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，云南 昆明 650201)

魔芋內(nèi)生拮抗細(xì)菌生防機(jī)理研究

周麗洪a，姬廣海a*，王永吉a，李淼a，楊俊a，魏蘭芳b*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.植物保護(hù)學(xué)院；b.農(nóng)科基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，云南 昆明 650201)

對(duì)自選魔芋內(nèi)生拮抗細(xì)菌M3、1–7、M2的生防機(jī)理進(jìn)行研究，結(jié)果表明，魔芋內(nèi)生菌M3、1–7、M2具有廣譜抗性，3株菌及其代謝粗提物對(duì)不同致病力的魔芋軟腐病菌均有拮抗作用；3株拮抗菌分別含有不同的抗菌素基因，1–7與魔芋軟腐病菌MY9的相似營養(yǎng)系數(shù)最高，達(dá)90.63%；M3在魔芋根際及體內(nèi)定殖能力均為最強(qiáng)，可達(dá)8.2×107CFU/g；接種時(shí)間、接種量及接種方式對(duì)生防效果影響較大，生防效果與拮抗菌接種量呈正相關(guān)，接種病原菌前1 d接種拮抗菌生防效果最優(yōu)，球包衣的防治效果優(yōu)于灌根，M3包衣防效可達(dá)79.15%；施入拮抗菌后，魔芋體內(nèi)和根際土壤微生物群落對(duì)底物代謝碳源利用的豐富度和代謝活性明顯提高。

魔芋；胡蘿卜軟腐果膠桿菌；內(nèi)生細(xì)菌; 生防機(jī)理

魔芋為天南星科魔芋屬(Amorphophallus)多年生草本塊莖植物[1]，是自然界僅有的幾種含有天然葡甘露聚糖的植物之一[2]，目前種植總面積已達(dá) 1.0×105hm2，年產(chǎn)量6.0×105～ 8.0×105t。由胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacterium carotovora subsp. carotovora，P.c.c.)引起的魔芋軟腐病是魔芋生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一[3]，在藥劑及無菌苗都不能有效控制該病的情況下，生物防治成為研究熱點(diǎn)。有研究[4]表明，眾多芽孢桿菌(Bacillus)對(duì)魔芋軟腐病菌均有良好的抑菌效果，但都難以在魔芋根際及體內(nèi)定殖。鑒于植物內(nèi)生細(xì)菌不僅能誘導(dǎo)和增強(qiáng)宿主植物對(duì)有害生物和環(huán)境脅迫的抗性[5–6]，而且能在寄主植物體內(nèi)大量定殖的優(yōu)勢，筆者針對(duì)前期篩選所獲得的3株魔芋內(nèi)生拮抗細(xì)菌，開展了內(nèi)生拮抗細(xì)菌生防機(jī)理及生防應(yīng)用等研究?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試魔芋內(nèi)生細(xì)菌：M3 (Bacilus subtilis)、1–7 (Pantoea agglomerans)、M2 (Bacillus amyloliquefaciens)[7]。供試病原菌：水稻白葉枯病菌53、煙草青枯病菌QK、煙草野火病菌CX10、大白菜軟腐病菌EW、馬蹄蓮軟腐病菌WM2、水稻條斑病菌Ynb、紅掌葉疫病菌XCD–S、三七根腐病菌SQGF–1、煙草黑脛病菌Phy–1、辣椒疫霉病菌LJYM–1、魔芋軟腐病菌強(qiáng)致病力菌株 MY9及弱致病力菌株MY4、MY6。所有供試菌株均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家工程中心細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室提供。供試培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[8]方法配制。

1.2 方 法

1.2.1 魔芋內(nèi)生拮抗細(xì)菌抑菌效果測定及抗菌素基因檢測

發(fā)酵液的獲得及3株魔芋內(nèi)生拮抗細(xì)菌對(duì)病原微生物的抗菌譜測定參照張麗輝[9]、熊國如等[10]的方法；內(nèi)生拮抗細(xì)菌對(duì)3株不同致病力的魔芋軟腐病菌(MY9、MY4、MY6)的拮抗測定參照張麗輝等[9]方法；內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)物粗體物的分離參照文獻(xiàn)[11]方法；代謝產(chǎn)物粗提物對(duì)病原菌MY9拮抗效果測定參照文獻(xiàn)[9]方法。陰性對(duì)照為乙酸乙酯。

3株魔芋內(nèi)生細(xì)菌和魔芋軟腐病菌 MY9營養(yǎng)利用情況參照文獻(xiàn)[12]方法，記錄各菌株對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的利用情況，并計(jì)算營養(yǎng)相似系數(shù)(NOI)值[13]。

內(nèi)生拮抗細(xì)菌抗菌素基因的檢測：參照文獻(xiàn)[13] 和[14]方法，合成4對(duì)引物，SF/SR(表面活性素合成必需基因srfA引物)、IF/IR(Iturin家族合成必需基因 ituB引物)、FF/FR(芬枯草菌素合成必需基因fenA引物)及SF/SR(抗菌蛋白基因tasA引物)。擴(kuò)增體系及程序及克隆連接參照連玲麗[13]、許曼琳等[14]研究方法。將陽性克隆子送上海生工(Sangon)生物技術(shù)公司測定序列。序列比對(duì)分析主要由Blastn程序和DNAman軟件完成。

1.2.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌生防效果的測定

參照文獻(xiàn)[9]和[12]方法，對(duì)3株拮抗細(xì)菌進(jìn)行定殖能力測定。

1) 接種時(shí)間對(duì)防效的影響。處理1，將內(nèi)生拮抗菌發(fā)酵液接種到表面消毒(75%乙醇)并打孔(直徑6 mm)的魔芋薯塊孔中，次日接種MY9；處理2，將拮抗菌發(fā)酵液和MY9同時(shí)接種到魔芋薯塊孔中；處理3，將MY9接種到魔芋薯塊孔中，次日再接種拮抗菌發(fā)酵液。對(duì)照組只接種MY9。拮抗菌與病原菌的接種濃度和接種量一致(3×108CFU/mL，60 μL)，28 ℃培養(yǎng)24～72 h，觀察軟腐情況。

2) 接種量對(duì)防效的影響。選取成熟期、長勢基本一致的健康植株，采用灌根法接種內(nèi)生拮抗菌發(fā)酵液，接種量分別為3×108、1.5×106、0.6×106CFU，次日采用灌根法接種3×108CFU的MY9；對(duì)照組只接種MY9。接種2周后調(diào)查發(fā)病情況。

3) 施藥方式對(duì)防效的影響。用100 mL 3×108CFU/mL的拮抗菌發(fā)酵液進(jìn)行種球包衣；魔芋完全展葉后1周進(jìn)行灌根處理，每株魔芋灌3×108CFU的拮抗菌發(fā)酵液；次日接種病原菌的方式及接種量同拮抗菌一致；對(duì)照組只接種MY9。接種2周后調(diào)查發(fā)病情況。

4) 內(nèi)生拮抗菌對(duì)魔芋體內(nèi)及根際微生物群落的影響。參照文獻(xiàn)[16–17]方法，采用 DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié) 果

2.1 魔芋內(nèi)生拮抗菌及其代謝物的抑菌效果

魔芋內(nèi)生細(xì)菌M3、M2、1–7對(duì)多種病原細(xì)菌及真菌都有拮抗作用，對(duì)歐文氏菌屬病原細(xì)菌的拮抗作用尤為明顯；對(duì)不同致病力的魔芋軟腐病菌均可產(chǎn)生拮抗作用，3株拮抗菌對(duì)MY9的拮抗效果比對(duì)MY4和MY6更強(qiáng)， M3對(duì)3株魔芋軟腐病菌拮抗效果均為最優(yōu)(表1)。

表1 魔芋內(nèi)生拮抗細(xì)菌的抑菌效果Table 1 The antibiogram of endogenous bacteria of A. konjac

拮抗菌代謝產(chǎn)物粗提物抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，M3、M2、1–7發(fā)酵液對(duì)MY9的抑菌圈直徑分別達(dá)2.97、1.97和1.43 cm；M3、M2的代謝產(chǎn)物粗提物對(duì)MY9有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈直徑分別達(dá)3.03 和1.67 cm；1–7的代謝產(chǎn)物粗提物對(duì)MY9無抑菌效果。

2.2 拮抗菌與軟腐病菌的營養(yǎng)競爭

32種碳源測定結(jié)果顯示，M3、M2、1–7與MY9營養(yǎng)相似系數(shù) NOI值分別為 65.63%、53.13%和90.63%，存在營養(yǎng)物資競爭關(guān)系，其中4株菌都能利用的營養(yǎng)物質(zhì)有糊精、N–乙酰–D–葡糖胺、L–阿拉伯糖、蔗糖、甲基丙酮酸、乙酸、甲酸、龍膽二糖、meso–肌醇、D–葡糖酸、D–甘露醇、D–阿洛酮糖、D–棉子糖、L–鼠李糖、葡糖–6–磷酸、甘油、L–天冬氨酸。

2.3 拮抗菌抗菌素基因的檢測結(jié)果

拮抗菌抗菌素基因檢測結(jié)果表明，1–7菌株含有表面活性素、伊枯草菌素和抗菌蛋白酶的編碼基因；M3含有伊枯草菌素和表面活性素的編碼基因；M2含有伊枯草菌素的編碼基因；3株菌均無芬枯草菌素編碼基因。

2.4 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的生防效果

2.4.1 拮抗細(xì)菌的定殖能力

3株魔芋內(nèi)生拮抗菌在魔芋根際土及體內(nèi)的定殖密度隨時(shí)間變化呈現(xiàn)先增后減趨勢，其中M3定殖能力最強(qiáng)。灌根11 d后，M3在1 g根際土的定殖量達(dá)最大值(8.2×107CFU)；灌根15 d后，M3在1 g魔芋葉片內(nèi)定殖量達(dá)到最大值(7.2×107CFU)；灌根5 d后，可在魔芋體內(nèi)檢測到生防菌，表明分離的內(nèi)生細(xì)菌成功進(jìn)入魔芋體內(nèi)(表2)。

表2 不同采樣時(shí)間3株拮抗菌在魔芋根際土壤和體內(nèi)的定殖量Table 2 The colonized ability of three antagonistic bacteria in A. konjac an d its r hizosphere soil at d ifferent sam pling times

2.4.2 接種量和接種時(shí)間及施藥方式對(duì)內(nèi)生拮抗菌防效的影響

不同接種量對(duì)防效的影響差異顯著，防效隨接種量降低而降低(表3)。生防菌提前或者同時(shí)與MY9接種的處理，腐爛面積較對(duì)照明顯減輕，生防效果更優(yōu)(表4)。種球包衣的防治效果整體優(yōu)于灌根處理(表5)。

表3 不同接種量下3株拮抗細(xì)菌的病情指數(shù)及相對(duì)防效Table 3 The disease index and biocontrol efficacy of three antagonistic bacteria with different inoculated concentration

表4 3株拮抗細(xì)菌不同接種時(shí)間的平均腐爛面積及腐爛減輕率Table 4 The average rot area and reduce the rate of decay of three antagonistic bacteria with different inoculated time

表5 3株拮抗細(xì)菌不同施藥方式的病情指數(shù)和相對(duì)防效Table 5 The disease index and biocontrol of three antagonistic bacteria with different inoculated methods

2.4.3 拮抗菌對(duì)魔芋體內(nèi)和根際微生物群落的影響

3株拮抗菌均可顯著提高魔芋體內(nèi)及根際微生物群落的碳源有效利用數(shù)量，其中拮抗菌M3、1–7提升碳源利用數(shù)量較M2更明顯；拮抗菌處理對(duì)魔芋根際土壤微生物群落影響更為明顯，M3、1–7、M2及對(duì)照組在魔芋體內(nèi)利用碳源數(shù)量分別為25、24、19、17，在根際利用碳源數(shù)量分別為28、27、23、21。

以培養(yǎng) 96 h時(shí)的光密度為依據(jù)計(jì)算微生物利用碳源的功能多樣性指數(shù)：3株菌處理后魔芋根際及體內(nèi)微生物的Shannon多樣性指數(shù)和 McLntosh指數(shù)均顯著高于對(duì)照處理；Shannon均勻度顯著低于對(duì)照(表6)。

表6 魔芋體內(nèi)和根際微生物群落多樣性指數(shù)Table 6 Microorganism communities diversity in A. konjac and its rhizosphere soil

平均顏色變化率(AWCD)是反映土壤微生物活性的一個(gè)重要指標(biāo)[17–19]。生防菌處理的魔芋體內(nèi)及根際微生物群落AWCD值分別在48、72 h后急劇升高；M3處理的AWCD始終最大(表7)。以Biolog ECO生態(tài)板中培養(yǎng)96 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，提取2個(gè)主成分進(jìn)行分析。魔芋根際土壤微生物群落累計(jì)貢獻(xiàn)率高達(dá)77.88%，主成分PC1及PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為47.73%和30.15%。不同處理在PC軸上有明顯分化，PC1軸上M3與M2處理分布于正方向上，1–7與對(duì)照處理則分布在負(fù)方向上；PC2軸上除M2處理外，其余處理均分布在正方向上，僅M2處理分布在負(fù)方向上。魔芋體內(nèi)微生物群落累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)66.18%，主成分PC1及PC2個(gè)貢獻(xiàn)率分別為43.16%，23.02%。不同處理在PC軸上有明顯分化，PC1軸上除對(duì)照處理外，其余處理均分布在正方向上；PC2軸上除M3處理外，其余處理均分布在負(fù)方向上。綜上所述，生防菌處理和對(duì)照處理分異大，且生防菌對(duì)魔芋體內(nèi)和根際土壤微生物的影響不同，表現(xiàn)出微生物群落的不穩(wěn)定性。對(duì)PC1和PC2具有較高利用率的碳源分析，各處理對(duì) PC1貢獻(xiàn)率較高的是糖類和代謝產(chǎn)物類物質(zhì)，代謝產(chǎn)物類物質(zhì)在PC1的權(quán)重較大，對(duì)PC2貢獻(xiàn)率較大的碳源主要是糖類。

表7 不同采樣時(shí)間魔芋體內(nèi)及根際微生物群落AWCD值Ta ble 7 AWCD of the microorganism communities in A. konjac and its rhizosphere soil with different sampling time

[1] 劉佩英．魔芋學(xué)[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004．

[2] Stephen A M，Cummings J H．Water-holding by dietary fibre in vitro and its relationship to faecal output in man[J]．Gut，1979，20：722–729．

[3] 馬瓊．魔芋軟腐病拮抗菌BJ–1的鑒定[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(5)：1936–1943．

[4] 劉琳，孫磊，張瑞英，等．春蘭根中可分泌吲哚乙酸的內(nèi)生細(xì)菌多樣性[J]．生物多樣性，2010，18(2)：182–187．

[5] Elbeltagy A，Nishioka K，Sato T，et al．Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by a Herbaspirillum sp．isolated from wild rice species[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67(11)：5285–5293．

[6] 韓冬梅，班慧芳，余子全，等．新型抑菌蛋白APr6抑制胡蘿卜軟腐歐文氏菌[J]．微生物學(xué)報(bào)，2008，48(9)： 1192–1197．

[7] 王永吉．魔芋軟腐病菌血清學(xué)檢測及其內(nèi)生拮抗細(xì)菌研究[D]．昆明：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，2012．[8] 方中達(dá)．植病研究方法[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：179–180．

[9] 張麗輝，王永吉，廖林，等．生防菌06?4 對(duì)魔芋軟腐病的防治及機(jī)理的初步研究[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，37(3)：286–289．

[10] 熊國如，趙更峰，范成明，等．生防菌株XF–1的鑒定和抑菌譜的測定[J]．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，24(2)：190–194．

[11] 魏蘭芳，周麗洪，姬廣海，等．Lysobacter antibioticus 13–1菌株抗菌物質(zhì)鑒定及對(duì)水稻白葉枯病的防治效果[J]．微生物學(xué)通報(bào)，2014，41(2)：274?280．

[12] 周麗洪，王永吉，韓陽，等．麗格海棠細(xì)菌性葉斑病病原菌鑒定[J]．西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，37(12)：56–61．

[13] 連玲麗．芽孢桿菌的生防菌株篩選及其抑病機(jī)理[D]．福州：福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，2007．

[14] 許曼琳．芽孢桿菌(Bacillus sp.)的抑菌作用和抗菌蛋白基因TasA的克隆和表達(dá)[D]．福州：福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，2005．

[15] 吳亞鵬，姬廣海，陳云蘭，等．生防細(xì)菌13?1對(duì)魔芋軟腐病的控制及機(jī)理研究[J]．中國生物防治，2010，26(2)：193?196．

[16] 楊永華，姚建，華曉梅，等．農(nóng)藥污染對(duì)土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]．微生物學(xué)雜志，2000，20(2)：23–25．

[17] 譚兆贊，劉可星，廖宗文．土壤微生物BIOLOG分析中特征碳源的判別[J]．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27 (4)：10–13．

[18] 米亮，隋躍宇，張興義，等．施肥對(duì)模擬侵蝕黑土土壤微生物群落代謝活性的影響[J]．農(nóng)業(yè)系統(tǒng)科學(xué)與綜合研究，2010，26(1)：97–101．

[19] 姬廣海，吳亞鵬，白學(xué)慧，等．抗生素溶桿菌對(duì)魔芋軟腐病和根際微生物多樣性的影響[J]．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(3)：499–503．

責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅 維

Mechanism of biocontrol of Amorphophallus konjac endophytic bacteria

ZHOU Li-honga, JI Guang-haia*, WANG Yong-jia, LI Miaoa, YANG Juna, WEI Lan-fangb*
(a.College of Plant Protection; b.Agricultural-Based Experimental Center, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

The mechanism of biocontrol of plant pathogens by antagonistic bacteria (M3, 1–7 and M2) endogenous in Amorphophallus konjac(A. konjac) was investigated. The results showed that the three strains inhibited a wide range of plant pathogens. The strains and their crude metabolites showed antagonistic effects to Pectobacterium carotovora sub sp.carotovora (Pcc) with different virulence. Three antagonistic bacteria contain different antibiotic genes and have high similarity in nutritional factors with Pcc. Three strains have a long-term colonization in the rhizosphere and in vivo A. konjac with a large number, among which M3 showed the strongest colonizing ability. Inoculation time, inoculum size and method showed a great influence on biocontrol effect which was positively correlated with inoculum size. Inoculation of the antagonistic bacteria 1 day before pathogen inoculation showed the best biocontrol effect. The control efficacy of coating was better than the effect of root watering and the control efficacy of M3 inoculated through coating reached 79.15%. After applying the antagonistic bacteria, utilization of substrate metabolism carbon source and metabolic activity of microbial communities in A. konjac and its rhizosphere soil improved significantly.

Amorphophallus konjac; Pectobacterium carotovora subsp.carotovora; endophytic bacteria; mechanism of biocontrol

Q 949.71+7.2；Q939.1

A

1007?1032(2014)03?0262?05

10.13331/j.cnki.jhau.2014.03.008

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2013–11–10

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項(xiàng)(201303015)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360002)； 云南省博士研究生學(xué)術(shù)新人獎(jiǎng)基金項(xiàng)目

周麗洪(1987—)，女，四川自貢人，博士研究生，主要從事植物細(xì)菌病害研究，zhuzhu.15983446361@aliyun.com；*通信作者，1121942876@qq.com；jghai001@aliyun.com