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    頸椎后縱韌帶骨化癥與BMP-2、BMP-4基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性研究

    2014-07-02 01:45:44耀魏威陳春悅?cè)~
    關(guān)鍵詞:骨化外顯子多態(tài)性

    周 耀魏 威陳春悅?cè)~ 楊

    1浙江省奉化市中醫(yī)醫(yī)院 奉化 315500 2浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

    頸椎后縱韌帶骨化癥與BMP-2、BMP-4基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性研究

    周 耀1魏 威2陳春悅2葉 楊2

    1浙江省奉化市中醫(yī)醫(yī)院 奉化 315500 2浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

    目的探討頸椎后縱韌帶骨化癥(OPLL)與BMP-2基因第3外顯子的rs79417223和BMP-4基因第4外顯子的rs147822607兩個(gè)SNP位點(diǎn)的相關(guān)性。方法選取47例浙江地區(qū)漢族頸椎后縱韌帶骨化癥患者,以100名正常個(gè)體作為對(duì)照組,采用PCR+Sanger DNA測(cè)序,統(tǒng)計(jì)分析2個(gè)位點(diǎn)基因型的分布信息。結(jié)果BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A患者、BMP-4第4外顯子的rs147822607A→C患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A、BMP-4基因、第4外顯子的rs147822607A→C,這2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與OPLL的發(fā)病具有強(qiáng)烈相關(guān)性。

    頸椎后縱韌帶骨化癥;單核苷酸多態(tài)性;易感基因;BMP-2基因;BMP-4基因

    頸椎后縱韌帶骨化癥(ossification of the posterior longitudinal ligament,OPLL)屬于一種骨成形病,表現(xiàn)為頸椎后縱韌帶內(nèi)異位骨的形成,主要壓迫脊髓產(chǎn)生臨床癥狀以及病理?yè)p害。OPLL為一種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致的復(fù)雜疾病(多基因疾?。1-6],高發(fā)于日本人以及亞洲人。通過(guò)檢索國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),我們選取2個(gè)可疑的OPLL易感基因多態(tài)性SNP位點(diǎn),BMP-2基因第 3外顯子的 rs79417223和BMP-4基因第4外顯子的rs147822607,進(jìn)行多態(tài)性分析,以期獲得這2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與浙江地區(qū)漢族OPLL患者發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)性。

    1 資料與方法

    1.1臨床資料 2010年7月—2013年9月就診于浙江省奉化市中醫(yī)院、浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院、解放軍一一七醫(yī)院等骨科的漢族OPLL患者47例,男30例,女17例,平均年齡(45.4±11.2)歲,病程0.3~8年,平均(4.1±1.2)年。根據(jù)頸部CT或者M(jìn)RI明確診斷[7]。患者籍貫均在浙江地區(qū)。同時(shí),以100名無(wú)血緣關(guān)系的浙江地區(qū)漢族正常個(gè)體作為對(duì)照組,男50名,女50名,平均年齡(43.1±7.3)歲。每位參與者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

    1.2方 法 ①DNA制備:入組者均在無(wú)菌環(huán)境下抽取外周血10mL(EDTA抗凝)。用外周血DNA純化試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)提取和純化基因組DNA。②PCR引物的合成:參考NCBI等人類基因組SNP數(shù)據(jù)庫(kù),用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2個(gè)基因SNP位點(diǎn)的PCR引物序列。引物由上海生工生物工程公司合成,引物序列見(jiàn)表1。③DNA測(cè)序分型對(duì)各多態(tài)性SNP位點(diǎn)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)Sanger DNA測(cè)序進(jìn)行基因分型。PCR產(chǎn)物的DNA測(cè)序委托上海生工生物工程公司進(jìn)行。根據(jù)基因分型結(jié)果,計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,采用χ2檢驗(yàn),P<0.05,表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2個(gè)多態(tài)性SNP位點(diǎn)的基因型分布經(jīng)χ2檢驗(yàn),符合Hardy-Weinberg遺傳平衡[8]。BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異(P<0.05)。BMP-4第4外顯子的rs147822607A→C患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異(P<0.01)。各等位基因在患者組與正常對(duì)照組中的分布和分析結(jié)果,見(jiàn)表2。

    表2 兩組rs79417223和rs147822607分布及比較 例

    3 討論

    OPLL是一種高發(fā)于日本人以及亞洲人的常見(jiàn)病。日本人的發(fā)病率約為1.9%~4.3%,韓國(guó)人約為3.6%,我國(guó)臺(tái)灣省約為2.8%,我國(guó)北方人群的OPLL發(fā)病率約為0.44%~8.92%,而北美白人僅為0.12%[1-3]。OPLL是引起脊髓病的重要原因,大部分可保持長(zhǎng)期穩(wěn)定狀態(tài),起病隱匿,進(jìn)展緩慢,呈現(xiàn)惡性發(fā)展趨勢(shì),可引起脊髓不可逆性損害,其中部分患者的脊髓功能出現(xiàn)急劇惡化[1]。OPLL的致癱風(fēng)險(xiǎn)顯著高于其他頸椎退行性疾病,其原因包括缺乏有效的早期篩選方法和診斷方法,自然史不明,無(wú)法確定手術(shù)時(shí)機(jī),術(shù)后骨化物持續(xù)生長(zhǎng)等。目前,臨床上尚無(wú)有效的方法延緩和改善OPLL的骨化過(guò)程,手術(shù)療法仍然是最主要的治療手段,但風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)較高[1]。1989年,Terayama等發(fā)現(xiàn),日本OPLL家系中先證者親屬的發(fā)病率顯著高于普通人群[4]。在北美OPLL患者中,盡管大部分病例為散發(fā)性,但仍可見(jiàn)部分病例具有家族聚集性[5]。目前已經(jīng)達(dá)成共識(shí),OPLL是一種嚴(yán)重危害人體健康的復(fù)雜性多基因遺傳病,其發(fā)病機(jī)制不詳,迄今沒(méi)有可靠的生物學(xué)識(shí)別指標(biāo)[1-2]。許多學(xué)者已做了大量的醫(yī)學(xué)研究來(lái)揭示OPLL發(fā)病的分子醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)[9]。

    骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)為多功能蛋白,具有獨(dú)特的骨形成作用和其他形態(tài)發(fā)生過(guò)程。BMP-2基因定位于20p12,而B(niǎo)MP-4基因位于14q22-q23。Kawaguchi等[10]曾發(fā)現(xiàn)某例OPLL患者術(shù)后標(biāo)本中的BMP-2僅表達(dá)于骨質(zhì)化的基質(zhì)、軟骨細(xì)胞以及鄰近OPLL軟骨的成纖維細(xì)胞中,而不在未骨質(zhì)化的頸椎后縱韌帶中表達(dá)。Kon等[11]對(duì)從OPLL和非OPLL患者的脊柱韌帶中分離到的成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)后,也發(fā)現(xiàn)BMP-2優(yōu)先誘導(dǎo)OPLL患者的成纖維細(xì)胞的成骨分化。Wang等[12]對(duì)192例漢族OPLL患者和304名健康對(duì)照的研究表明,具有BMP-2基因第3外顯子SNP TC和CC基因型的男性更易罹患OPLL。Karasugi等[2]最新的一項(xiàng)對(duì)214例日本OPLL患病同胞對(duì)的大規(guī)模全基因組連鎖分析研究顯示,OPLL最有可能的易感基因區(qū)域位于20p12的微衛(wèi)星標(biāo)記D20S894附近(NPL= 3.43,P=0.000,27)。而Furushima等[13]對(duì)126例日本OPLL患病同胞對(duì)進(jìn)行了的大規(guī)模候選基因篩查發(fā)現(xiàn),僅BMP-4基因與OPLL顯著關(guān)聯(lián)(NPL=2.230,P=0.035)。本研究分別選取了BMP-2第3外顯子的rs79417223和BMP-4第4外顯子的rs147822607兩個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異(P<0.05)。BMP-4第4外顯子的rs147822607A→C患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異(P<0.01)。本研究提示BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A、BMP-4基因第4外顯子的rs147822607A→C,這2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與OPLL的發(fā)病具有強(qiáng)烈相關(guān)性。

    由于取材等方面的原因,目前直接在人頸椎后縱韌帶組織細(xì)胞水平上探討OPLL的易感基因表達(dá)水平還比較困難,加之該病呈復(fù)雜性多基因遺傳方式,并表現(xiàn)出強(qiáng)烈的遺傳異質(zhì)性和表型異質(zhì)性,因而尚無(wú)法準(zhǔn)確地確定致病基因,并闡釋易感基因的基因-基因、基因-環(huán)境之間的相互作用及其在OPLL發(fā)病中的地位[1-3,9]。因此,對(duì)大樣本患者群體進(jìn)行可疑易感基因的SNP分型,尋找和鑒定相關(guān)的致病基因,是切實(shí)可行的研究方法之一。由于受時(shí)間、地點(diǎn)限制,本研究只收集到了47例浙江地區(qū)漢族OPLL患者,選擇了2個(gè)基因多態(tài)性SNP位點(diǎn)進(jìn)行了初步研究。研究結(jié)果提示此位點(diǎn)與OPLL的發(fā)病具有強(qiáng)烈相關(guān)性。但本研究的患者均來(lái)自于中國(guó)浙江地區(qū),而且研究的樣本數(shù)又相對(duì)偏小,所以研究結(jié)果與以前文獻(xiàn)報(bào)道可能會(huì)存在有一些差異。在今后的研究中,可以將樣本再擴(kuò)大化,并且運(yùn)用目前先進(jìn)的外顯子捕獲二代測(cè)序技術(shù)運(yùn)用于OPLL基因外顯子組水平的分析研究,以獲得OPLL發(fā)生的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)[9]。

    [1]Saetia K,Cho D,Lee S,et al.Ossification of the posterior longitudinal ligament:a review[J].Neurosurg Focus,2011,30(3):E1.

    [2]Karasugi T,Nakajima M,Ikari K,et al.A genome-wide sibpair linkage analysis of ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine[J].J Bone Miner Metab,2013,31(2):136-143.

    [3]魏威,張永華,石仕元.頸椎后縱韌帶骨化癥的易感基因研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2010,18(4):11-13.

    [4]Terayama K.Genetic studies on ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine[J].Spine,1989,14(11):1184-1191.

    [5]Tanabe J,Sarin H,Kindt G.Familial ossification of the posterior longitudinal ligament(OPLL)in the thoracic spine:Case report[J].Surg Neurol,2002,58(6):403-405.

    [6]Washio M,Kobashi G,Okamoto K,et al.Sleeping habit and other life styles in the prime of life and risk for ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine(OPLL):Acase-control study in Japan[J].J Epidemiol,2004,14(5):168-173.

    [7]Tsuyama N.Ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine[J].Clin Orthop Relat Res,1984,18(4):71-84.

    [8]Guo SW,Thompson E.Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiple alleles[J].Biometrics,1992,48:361-372.

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    [10]Kawaguchi H,Kurokawa T,Hoshino Y,et al.Immunohistochemical demonstration of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-β in the ossification of the posterior longitudinal ligament of the cervical spine[J]. Spine,1992,17(Suppl 3):S33-S36.

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    [13]Furushima K,Shimo-Onoda K,Maeda S,et al.Large-scale screening for candidate genes of ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine[J].J Bone Miner Res,2002,17(1):128-137.

    Relationship Between the Gene Polymorphisms of BMP-2 and BMP-4 with Ossification of Posterior Longitudinal Ligament of the Spine in a Chinese population

    ZHOU Yao1,WEI Wei2,CHEN Chunyue2,YE Yang2. 1 Fenghua Chinese Medical Hospital of Zhejiang Province,Fenghua(315500),China;2 Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province

    ObjectiveTo explore the relationship between 2 single nucleotide polymorphisms(SNPs)of BMP-2 and BMP-4 and ossification of posterior longitudinal ligament of the spine(OPLL)in a Chinese population.MethodsForty-seven sporadic OPLL patients and 100 healthy controls in Zhejiang area were recruited for association analysis.The SNP regions of BMP-2 and BMP-4 genes were amplified by PCR and Sanger sequencing.Genotype frequencies of the SNPs were compared between the cases and control subjects with SPSS 13.0 software.ResultsBoth Of the rs79417223 G→A site in the exon 3 of BMP-2 and the rs147822607 A→C site in the exon 4 of BMP-4,the patient and normal control groups showed significant differences(P<0.05,P<0.01).ConclusionsThe rs79417223 and rs147822607 have a strong correlation to OPLL.

    ossification of posterior longitudinal ligament;single nucleotide polymorphism;susceptibility gene;BMP-2 gene;BMP-4 gene

    2013-12-01

    浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2010KY168),浙江省寧波市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013C50023)

    葉楊,E-mail:dagou1234@163.com

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