頸椎后縱韌帶骨化癥與BMP-2、BMP-4基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性研究

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1浙江省奉化市中醫(yī)醫(yī)院 奉化 315500 2浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

頸椎后縱韌帶骨化癥與BMP-2、BMP-4基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性研究

周 耀1魏 威2陳春悅2葉 楊2

1浙江省奉化市中醫(yī)醫(yī)院 奉化 315500 2浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

目的探討頸椎后縱韌帶骨化癥（OPLL）與BMP-2基因第3外顯子的rs79417223和BMP-4基因第4外顯子的rs147822607兩個(gè)SNP位點(diǎn)的相關(guān)性。方法選取47例浙江地區(qū)漢族頸椎后縱韌帶骨化癥患者，以100名正常個(gè)體作為對(duì)照組，采用PCR+Sanger DNA測(cè)序，統(tǒng)計(jì)分析2個(gè)位點(diǎn)基因型的分布信息。結(jié)果BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A患者、BMP-4第4外顯子的rs147822607A→C患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A、BMP-4基因、第4外顯子的rs147822607A→C，這2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與OPLL的發(fā)病具有強(qiáng)烈相關(guān)性。

頸椎后縱韌帶骨化癥；單核苷酸多態(tài)性；易感基因；BMP-2基因；BMP-4基因

頸椎后縱韌帶骨化癥（ossification of the posterior longitudinal ligament，OPLL）屬于一種骨成形病，表現(xiàn)為頸椎后縱韌帶內(nèi)異位骨的形成，主要壓迫脊髓產(chǎn)生臨床癥狀以及病理?yè)p害。OPLL為一種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致的復(fù)雜疾病（多基因疾?。1-6]，高發(fā)于日本人以及亞洲人。通過(guò)檢索國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，我們選取2個(gè)可疑的OPLL易感基因多態(tài)性SNP位點(diǎn)，BMP-2基因第 3外顯子的 rs79417223和BMP-4基因第4外顯子的rs147822607，進(jìn)行多態(tài)性分析，以期獲得這2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與浙江地區(qū)漢族OPLL患者發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2010年7月—2013年9月就診于浙江省奉化市中醫(yī)院、浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院、解放軍一一七醫(yī)院等骨科的漢族OPLL患者47例，男30例，女17例，平均年齡（45.4±11.2）歲，病程0.3～8年，平均（4.1±1.2）年。根據(jù)頸部CT或者M(jìn)RI明確診斷[7]。患者籍貫均在浙江地區(qū)。同時(shí)，以100名無(wú)血緣關(guān)系的浙江地區(qū)漢族正常個(gè)體作為對(duì)照組，男50名，女50名，平均年齡（43.1±7.3）歲。每位參與者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2方 法 ①DNA制備：入組者均在無(wú)菌環(huán)境下抽取外周血10mL（EDTA抗凝）。用外周血DNA純化試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）提取和純化基因組DNA。②PCR引物的合成：參考NCBI等人類基因組SNP數(shù)據(jù)庫(kù)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2個(gè)基因SNP位點(diǎn)的PCR引物序列。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列見(jiàn)表1。③DNA測(cè)序分型對(duì)各多態(tài)性SNP位點(diǎn)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)Sanger DNA測(cè)序進(jìn)行基因分型。PCR產(chǎn)物的DNA測(cè)序委托上海生工生物工程公司進(jìn)行。根據(jù)基因分型結(jié)果，計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05，表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2個(gè)多態(tài)性SNP位點(diǎn)的基因型分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡[8]。BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異（P＜0.05）。BMP-4第4外顯子的rs147822607A→C患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異（P＜0.01）。各等位基因在患者組與正常對(duì)照組中的分布和分析結(jié)果，見(jiàn)表2。

表2 兩組rs79417223和rs147822607分布及比較 例

3 討論

OPLL是一種高發(fā)于日本人以及亞洲人的常見(jiàn)病。日本人的發(fā)病率約為1.9%～4.3%，韓國(guó)人約為3.6%，我國(guó)臺(tái)灣省約為2.8%，我國(guó)北方人群的OPLL發(fā)病率約為0.44%～8.92%，而北美白人僅為0.12%[1-3]。OPLL是引起脊髓病的重要原因，大部分可保持長(zhǎng)期穩(wěn)定狀態(tài)，起病隱匿，進(jìn)展緩慢，呈現(xiàn)惡性發(fā)展趨勢(shì)，可引起脊髓不可逆性損害，其中部分患者的脊髓功能出現(xiàn)急劇惡化[1]。OPLL的致癱風(fēng)險(xiǎn)顯著高于其他頸椎退行性疾病，其原因包括缺乏有效的早期篩選方法和診斷方法，自然史不明，無(wú)法確定手術(shù)時(shí)機(jī)，術(shù)后骨化物持續(xù)生長(zhǎng)等。目前，臨床上尚無(wú)有效的方法延緩和改善OPLL的骨化過(guò)程，手術(shù)療法仍然是最主要的治療手段，但風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)較高[1]。1989年，Terayama等發(fā)現(xiàn)，日本OPLL家系中先證者親屬的發(fā)病率顯著高于普通人群[4]。在北美OPLL患者中，盡管大部分病例為散發(fā)性，但仍可見(jiàn)部分病例具有家族聚集性[5]。目前已經(jīng)達(dá)成共識(shí)，OPLL是一種嚴(yán)重危害人體健康的復(fù)雜性多基因遺傳病，其發(fā)病機(jī)制不詳，迄今沒(méi)有可靠的生物學(xué)識(shí)別指標(biāo)[1-2]。許多學(xué)者已做了大量的醫(yī)學(xué)研究來(lái)揭示OPLL發(fā)病的分子醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)[9]。

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）為多功能蛋白，具有獨(dú)特的骨形成作用和其他形態(tài)發(fā)生過(guò)程。BMP-2基因定位于20p12，而B(niǎo)MP-4基因位于14q22-q23。Kawaguchi等[10]曾發(fā)現(xiàn)某例OPLL患者術(shù)后標(biāo)本中的BMP-2僅表達(dá)于骨質(zhì)化的基質(zhì)、軟骨細(xì)胞以及鄰近OPLL軟骨的成纖維細(xì)胞中，而不在未骨質(zhì)化的頸椎后縱韌帶中表達(dá)。Kon等[11]對(duì)從OPLL和非OPLL患者的脊柱韌帶中分離到的成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)后，也發(fā)現(xiàn)BMP-2優(yōu)先誘導(dǎo)OPLL患者的成纖維細(xì)胞的成骨分化。Wang等[12]對(duì)192例漢族OPLL患者和304名健康對(duì)照的研究表明，具有BMP-2基因第3外顯子SNP TC和CC基因型的男性更易罹患OPLL。Karasugi等[2]最新的一項(xiàng)對(duì)214例日本OPLL患病同胞對(duì)的大規(guī)模全基因組連鎖分析研究顯示，OPLL最有可能的易感基因區(qū)域位于20p12的微衛(wèi)星標(biāo)記D20S894附近（NPL= 3.43，P=0.000，27）。而Furushima等[13]對(duì)126例日本OPLL患病同胞對(duì)進(jìn)行了的大規(guī)模候選基因篩查發(fā)現(xiàn)，僅BMP-4基因與OPLL顯著關(guān)聯(lián)（NPL=2.230，P=0.035）。本研究分別選取了BMP-2第3外顯子的rs79417223和BMP-4第4外顯子的rs147822607兩個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異（P＜0.05）。BMP-4第4外顯子的rs147822607A→C患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異（P＜0.01）。本研究提示BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A、BMP-4基因第4外顯子的rs147822607A→C，這2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與OPLL的發(fā)病具有強(qiáng)烈相關(guān)性。

由于取材等方面的原因，目前直接在人頸椎后縱韌帶組織細(xì)胞水平上探討OPLL的易感基因表達(dá)水平還比較困難，加之該病呈復(fù)雜性多基因遺傳方式，并表現(xiàn)出強(qiáng)烈的遺傳異質(zhì)性和表型異質(zhì)性，因而尚無(wú)法準(zhǔn)確地確定致病基因，并闡釋易感基因的基因-基因、基因-環(huán)境之間的相互作用及其在OPLL發(fā)病中的地位[1-3，9]。因此，對(duì)大樣本患者群體進(jìn)行可疑易感基因的SNP分型，尋找和鑒定相關(guān)的致病基因，是切實(shí)可行的研究方法之一。由于受時(shí)間、地點(diǎn)限制，本研究只收集到了47例浙江地區(qū)漢族OPLL患者，選擇了2個(gè)基因多態(tài)性SNP位點(diǎn)進(jìn)行了初步研究。研究結(jié)果提示此位點(diǎn)與OPLL的發(fā)病具有強(qiáng)烈相關(guān)性。但本研究的患者均來(lái)自于中國(guó)浙江地區(qū)，而且研究的樣本數(shù)又相對(duì)偏小，所以研究結(jié)果與以前文獻(xiàn)報(bào)道可能會(huì)存在有一些差異。在今后的研究中，可以將樣本再擴(kuò)大化，并且運(yùn)用目前先進(jìn)的外顯子捕獲二代測(cè)序技術(shù)運(yùn)用于OPLL基因外顯子組水平的分析研究，以獲得OPLL發(fā)生的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)[9]。

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Relationship Between the Gene Polymorphisms of BMP-2 and BMP-4 with Ossification of Posterior Longitudinal Ligament of the Spine in a Chinese population

ZHOU Yao1,WEI Wei2,CHEN Chunyue2,YE Yang2. 1 Fenghua Chinese Medical Hospital of Zhejiang Province,Fenghua(315500),China;2 Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province

ObjectiveTo explore the relationship between 2 single nucleotide polymorphisms（SNPs）of BMP-2 and BMP-4 and ossification of posterior longitudinal ligament of the spine（OPLL）in a Chinese population.MethodsForty-seven sporadic OPLL patients and 100 healthy controls in Zhejiang area were recruited for association analysis.The SNP regions of BMP-2 and BMP-4 genes were amplified by PCR and Sanger sequencing.Genotype frequencies of the SNPs were compared between the cases and control subjects with SPSS 13.0 software.ResultsBoth Of the rs79417223 G→A site in the exon 3 of BMP-2 and the rs147822607 A→C site in the exon 4 of BMP-4，the patient and normal control groups showed significant differences（P＜0.05，P＜0.01）.ConclusionsThe rs79417223 and rs147822607 have a strong correlation to OPLL.

ossification of posterior longitudinal ligament；single nucleotide polymorphism；susceptibility gene；BMP-2 gene；BMP-4 gene

2013-12-01

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2010KY168），浙江省寧波市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2013C50023）

葉楊，E-mail：dagou1234@163.com