蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠血漿和腦脊液神經(jīng)肽Y變化及其與腦血管痙攣的相關(guān)性

鐘長(zhǎng)揚(yáng) 杭州市第三人民醫(yī)院 杭州 310006

蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠血漿和腦脊液神經(jīng)肽Y變化及其與腦血管痙攣的相關(guān)性

鐘長(zhǎng)揚(yáng) 杭州市第三人民醫(yī)院 杭州 310006

目的探討蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）大鼠血漿及腦脊液神經(jīng)肽Y（NPY）的變化趨勢(shì)，分析NPY濃度與腦血管痙攣（CVS）的相關(guān)性。方法SD大鼠25只，隨機(jī)分為對(duì)照組和SAH后1h、12h、1d、7d組共5組，每組5只。除對(duì)照組外，另4組枕大池注血制備SAH大鼠模型。放射免疫法測(cè)定各組NPY濃度，激光多普勒血流儀測(cè)量局部腦血流量（rCBF）。結(jié)果SAH大鼠1h、12h、1d組血液NPY濃度分別為（44.90±5.92）、（66.27±7.04）、（91.43±10.90）ng/mL，腦脊液NPY濃度分別為（102.98±13.54）、（142.38±36.79）、（195.26±22.30）ng/mL，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Pearson相關(guān)分析顯示，SAH大鼠血液（r=-0.585，P=0.007）、腦脊液（r=-0.545，P=0.013）NPY含量均與rCBF呈顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)論SAH大鼠血液及腦脊液中NPY含量于1h即開始升高，12h達(dá)高峰，之后逐漸下降，至7天恢復(fù)正常。SAH大鼠血液及腦脊液NPY含量與rCBF呈顯著負(fù)相關(guān)，與CVS存在相關(guān)性。

大鼠；蛛網(wǎng)膜下腔出血；神經(jīng)肽Y；腦血管痙攣

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是由于外傷、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂、動(dòng)靜脈畸形等多種原因?qū)е卵哼M(jìn)入顱內(nèi)或椎管內(nèi)的蛛網(wǎng)膜下腔，引起以頭暈、頭痛、嘔吐、癲癇發(fā)作等表現(xiàn)的臨床綜合征。腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS）是繼發(fā)于蛛網(wǎng)膜下腔出血的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，如不及時(shí)診斷及干預(yù)，病情進(jìn)展可以引起腦部缺血，甚至永久性神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損[1]。目前，仍未明確CVS的確切機(jī)制，何種物質(zhì)在這一系列病理生理過程中起主要作用尚不清楚。前期研究表明[2]，神經(jīng)肽Y（NPY）廣泛分布于人和動(dòng)物的許多器官，在腦的各個(gè)區(qū)域亦都存在，NPY具有重要的血管收縮作用，CVS發(fā)生后，血漿NPY水平升高，導(dǎo)致CVS進(jìn)一步加重。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察SAH大鼠血漿及腦脊液NPY濃度變化，并探討其與CVS的相關(guān)性，在闡明NPY機(jī)制的同時(shí)，尋找降低SAH后CVS致死、致殘率的新方法。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備 健康3月齡SD大鼠25只（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：2008001635958），清潔級(jí)，體質(zhì)量300～350g，雌雄不限，隨機(jī)分為對(duì)照組和SAH后1h、12h、1d和7d組共5組，每組5只。SAH各組采用枕大池注血制作蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游锬Ｐ蚚2]：10%水合氯醛（400mg/100g）腹腔內(nèi)麻醉，小心分離枕部肌肉，找到環(huán)枕膜，無菌操作穿刺枕大池，緩慢放腦脊液0.5mL后，取腹動(dòng)脈新鮮之抗凝血0.5mL，立即緩慢注入枕大池，保持頭低位30min，48h后重復(fù)上述操作1次。對(duì)照組枕大池注入等量溫生理鹽水。

1.2rCBF測(cè)量方法 制備模型成功后，處死大鼠，處死前先行腹腔麻醉，逐層切開顱頂正中皮膚，然后用牙科鉆在大鼠前囟后、中線左側(cè)各3mm處鉆一直徑3～4mm小孔，將直徑2.5mm的激光多普勒血流儀探頭垂直置放硬腦膜上，測(cè)量rCBF并記錄。

1.3血液及腦脊液標(biāo)本取材 在大鼠右心耳抽取2mL血液標(biāo)本，然后注入含10%EDTA2Na 50μL和抑肽酶50μL試管中，盡快在3000rpm/min離心機(jī)離心10min分離得血漿，-20℃冰箱保存待測(cè)。腦脊液標(biāo)本于枕大池穿刺抽CSF 0.1～0.2mL，冷凍干燥后存于-20℃冰箱保存待測(cè)。

1.4NPY濃度測(cè)定 采用放射免疫法檢測(cè)，NPY標(biāo)記物購自Amershan公司。標(biāo)本制作完畢后再Y記數(shù)儀測(cè)定cpm數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件，計(jì)數(shù)資料以（） 表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＜0.05。

2 結(jié)果

2.1各組NPY濃度比較 SAH大鼠1h、12h和1d組血液及腦脊液NPY含量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SAH 7d組與對(duì)照組NPY含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組血液、腦脊液NPY濃度比較（） ng/mL

表1 各組血液、腦脊液NPY濃度比較（） ng/mL

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

?

2.2各組rCBF比較 SAH 1h、12h和1d組rCBF與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。SAH組rCBF呈雙相變化，SAH1h rCBF降至最低，到12h時(shí)有所恢復(fù)，之后再次下降，到7d時(shí)上升至正常，見表2。

表2 各組rCBF比較（）

表2 各組rCBF比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

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2.3SAH各組NPY濃度與rCBF相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，SAH組血液（r=-0.585，P=0.007）、腦脊液（r=-0.545，P=0.013）NPY含量與rCBF呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論

神經(jīng)肽Y廣泛分布于腦的各個(gè)區(qū)域，同時(shí)也存在于腦血管，其中以基底動(dòng)脈分叉處、大腦前動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處含量最高[3]。在外周，主要與去甲腎上腺素共同貯存于交感神經(jīng)節(jié)，血液中的部分來源于交感神經(jīng)，另一部分則來自于血小板，在血小板聚集時(shí)釋放[4]。NPY廣泛存在于腦血管及神經(jīng)纖維中，在SAH后NPY有增強(qiáng)其他縮血管物質(zhì)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激或交感神經(jīng)刺激時(shí)，NPY和去甲腎上腺素的分泌增加[5]，而NYP的分泌增加直接引起血管平滑肌的收縮，并增強(qiáng)了血管對(duì)縮血管物質(zhì)的敏感性[6-7]。NPY具有強(qiáng)烈的縮血管作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[8]，在大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)注入一定劑量的NPY后，大腦皮質(zhì)平均血流可下降40%～98%，并且血流下降的情況至少可以持續(xù)2h，這與本研究的結(jié)果相符。此外，季鷹等[9]研究發(fā)現(xiàn)，NPY對(duì)大鼠腦血管有很強(qiáng)的收縮作用，與5-HT、NE等血管活性物質(zhì)比較，其血管收縮作用明顯增強(qiáng)，并且可以加強(qiáng)NE、5-HT的縮血管效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血漿及腦脊液NPY水平在發(fā)病后不同時(shí)期含量不同，SAH大鼠血液及腦脊液中NPY含量于實(shí)驗(yàn)后1h即開始升高，12h可達(dá)到高峰，但隨后逐漸下降，至7d時(shí)恢復(fù)至正常水平。與對(duì)照組比較，大鼠SAH 1h、12h和1d的血漿及腦脊液NPY含量均有顯著差異（P＜0.05）。同期測(cè)得的rCBF值顯著下降，Pearson相關(guān)分析顯示，SAH組血液（r=-0.585，P=0.007）、腦脊液（r=-0.545，P=0.013）NPY含量與rCBF呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，認(rèn)為NPY濃度升高與SAH后腦血管痙攣有關(guān)。

目前，關(guān)于CVS的發(fā)生機(jī)制主要有代謝性和神經(jīng)控制性兩種觀點(diǎn)，通過神經(jīng)調(diào)節(jié)及血管活性物質(zhì)的釋放實(shí)現(xiàn)腦血流量的自動(dòng)調(diào)節(jié)。從發(fā)生時(shí)期來看，CVS分為早發(fā)期和遲發(fā)期[8]，早發(fā)期在SAH后數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)即可發(fā)生，而遲發(fā)期多發(fā)生于出血后4天至2周，7～10天為發(fā)病的高峰期。NPY的病理生理機(jī)制復(fù)雜，綜合目前國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為，SAH時(shí)NYP濃度升高可能與以下因素有關(guān)[10-11]：①應(yīng)激導(dǎo)致交感神經(jīng)末梢NYP釋放過多；②血管內(nèi)膜損傷，血小板激活，使NPY釋放增加；③顱內(nèi)壓升高引起下丘腦植物神經(jīng)功能紊亂，NPY釋放增加；④SAH后顱內(nèi)血腫的破壞作用引起腦組織釋放NYP增加。

目前，NPY的變化趨勢(shì)及其病理生理機(jī)制尚未完全闡明，尚缺乏大型研究證據(jù)來確定NPY的時(shí)間窗，同時(shí)尚需進(jìn)一步從解剖生理、分子、細(xì)胞水平入手，闡明CVS的機(jī)制及其發(fā)生過程中NPY、神經(jīng)降壓素等的變化。

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Changes of Neuropeptide Y in Sera and Cerebral Fluid in Subarachnoid Hemorrhage Rats and Its Relationship with Cerebral Vasospasm

ZHONG Changyang.The Third People's Hospital of Hangzhou,Hangzhou (310006),China

ObjectiveTo observe the changes of neuropeptide Y（NPY）in sera and cerebral fluid（CBF）in subarachnoid hemorrhage（SAH）rats and its relationship with cerebral vasospasm.MethodsTwenty-five SD rats were randomly divided into control group,post-SAH 1h,12h,1d,and 7d groups（n=5）.Except for control group, SAH model was established by injection of autologous blood into the rat's cisterna magna.The content of NPY was determined by radioimmunoassay.Regional cerebral fluid was measured by laser Doppler flowmeter.ResultsThe contents of serum NPY were（44.90±5.92）,（66.27±7.04）,and（91.43±10.90）ng/mL and the contents of NPY in CBF were（102.98±13.54）,（142.38±36.79）,and（195.26±22.30）ng/mL in post SAH 1h,12h,1d groups,with significant differences when compared with control group（P＜0.05）.Pearson correlation analysis showed that the contents of NPY in sera and CBF were negatively correlated to regional CBF（r=-0.585，P=0.007;r=-0.545，P=0.013）.ConclusionThe contents of NPY in sera and CBF began to increase 1h after SAH,peaked at 12h,and reduced to baseline at 7d.It is negatively correlated to regional CBF,indicating a relationship with cerebral vasospasm.

rats；subarachnoid hemorrhage；neuropeptide Y；cerebral vasospasm

2013-11-20

杭州市衛(wèi)生科技計(jì)劃（一般）項(xiàng)目（No.2011A025）