大黃素治療裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤的實(shí)驗(yàn)研究

徐賢綢溫培楠王兆洪劉 岸楊偉青

1浙江省平陽(yáng)縣人民醫(yī)院普外科 平陽(yáng) 325400 2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤外科

大黃素治療裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤的實(shí)驗(yàn)研究

徐賢綢1溫培楠1王兆洪2劉 岸2楊偉青1

1浙江省平陽(yáng)縣人民醫(yī)院普外科 平陽(yáng) 325400 2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤外科

目的觀察大黃素及其脂質(zhì)體對(duì)裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移模型影響及作用機(jī)制。方法建立裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、吉西他濱組、實(shí)驗(yàn)Ⅰ組、實(shí)驗(yàn)Ⅱ組和實(shí)驗(yàn)Ⅲ組，每組10只，分別經(jīng)脾臟注射給予10%葡萄糖、吉西他濱100mg/kg、大黃素10mg/kg、大黃素脂質(zhì)體5mg/kg和大黃素脂質(zhì)體10mg/kg。觀察各組荷瘤裸鼠肝轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)情況，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織Ki-67和CD-34表達(dá)，Tunel法檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞凋亡，Western blotting法檢測(cè)腫瘤組織MMP-2和MMP-9表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組比較，吉西他濱組、實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組肝轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)明顯抑制（P均＜0.05）；與實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組比較，實(shí)驗(yàn)Ⅲ組腫瘤縮小更明顯（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)Ⅲ組瘤重與吉西他濱組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組腫瘤組織Ki-67、CD34、MMP-2和MMP-9表達(dá)較對(duì)照組均明顯降低（P均＜0.05），而凋亡細(xì)胞明顯增加（P均＜0.05）。結(jié)論大黃素及其脂質(zhì)體均有抗裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤的作用，但后者作用更為明顯，其機(jī)制可能與抑制胰腺癌組織MMP-2和MMP-9表達(dá)有關(guān)。

小鼠；胰腺腫瘤；腫瘤轉(zhuǎn)移；大黃素；脂質(zhì)體

胰腺癌為消化道惡性腫瘤，多數(shù)患者確診時(shí)因已合并肝等部位轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)機(jī)會(huì)，吉西他濱作為治療胰腺癌的首選化療藥物，其治療有效率也不高，同時(shí)存在一定毒副反應(yīng)[1-2]。因此，有必要尋求一種低毒高效的藥物以控制胰腺癌及肝轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)，改善進(jìn)展期胰腺癌患者預(yù)后。筆者采用薄膜-超聲分散法制備大黃素脂質(zhì)體，以吉西他濱作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察大黃素及其脂質(zhì)體治療裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤的效果，并初步探討其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物和細(xì)胞株 4～6周齡雌性BALB/c-nu/nu品系裸小鼠，無特定病原體（SPF）級(jí)，體質(zhì)量（18.56± 0.85)g，購(gòu)自中科院上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)，動(dòng)物飼料和水等經(jīng)嚴(yán)格滅菌處理。人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購(gòu)自ATCC，細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，含1%的青-鏈霉素，在5%CO2和37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2藥物和試劑 大黃素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，采用薄膜-超聲分散法[3]制備大黃素脂質(zhì)體，大黃素納米脂質(zhì)體為淺黃色透明膠體，在電鏡下呈完整圓球形或橢圓形的球粒，粒徑約為25nm，含量為（2.1± 0.2）mg/mL，包封率為（98.26±0.38）%；胎牛血清、含EDTA胰酶和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Ki-67和CD34抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；ABC免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自瑞士羅氏公司；MMP-2、MMP-9和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3模型建立和給藥 裸鼠胰腺癌皮下移植瘤制備：取2×106個(gè)指數(shù)生長(zhǎng)期的SW1990細(xì)胞注射至裸鼠左下肢外側(cè)皮下組織，3周后待皮下移植瘤生長(zhǎng)成1cm3后取出，將腫瘤組織剪成1mm3的組織塊備用。裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移模型制備：取1mm3的瘤塊，置于16#帶針芯穿刺針內(nèi)，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉裸鼠，行上腹正中切口約1cm，暴露肝左葉，刺入穿刺針，將瘤塊種植于裸鼠肝左葉，縫合裸鼠腹壁。共制備50只裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，并隨機(jī)分成5組，每組10只。對(duì)照組每只給予10%葡萄糖0.1mL；吉西他濱組給予吉西他濱100mg/kg；實(shí)驗(yàn)Ⅰ組給予大黃素10mg/kg；實(shí)驗(yàn)Ⅱ組給予大黃素脂質(zhì)體5mg/ kg；實(shí)驗(yàn)Ⅲ組給予大黃素脂質(zhì)體10mg/kg。手術(shù)后第4天開始通過皮試針頭經(jīng)脾下極注射給藥，術(shù)后第3周處死裸鼠，完整剝?nèi)「闻K腫瘤組織，稱重并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（1-治療組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重）×100%

1.4腫瘤組織Ki-67和CD34測(cè)定 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。按照Envision法的操作步驟進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，每組選取5個(gè)標(biāo)本經(jīng)正常羊血清封閉非特異性抗原，加入一抗孵育過夜后，加入生物素標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水后封片。低倍鏡（×100）下隨機(jī)選擇20個(gè)視野，圖片結(jié)果用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析Ki-67和CD34的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度。

1.5腫瘤組織細(xì)胞凋亡 采用Tunel法檢測(cè)。按Tunel試劑盒說明書操作，細(xì)胞核固縮、染色體凝集成塊、呈棕褐色染色者為凋亡細(xì)胞，低倍鏡（100×）下觀察20個(gè)視野，圖片結(jié)果用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件進(jìn)行分析。

1.6腫瘤組織蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)。將腫瘤組織粉碎后加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取上清液。用Bradford法測(cè)量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品（20μg/孔），常規(guī)8%SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（1: 1000）于4℃下孵育過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體（1:2500）室溫孵育1h，ECL顯色，條帶暴光強(qiáng)度用Quantity One 4.6.2（BIO，RAD）軟件分析，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)所得計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大黃素對(duì)裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)的影響 各組裸鼠死亡情況：實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)Ⅱ組和實(shí)驗(yàn)Ⅲ組裸鼠進(jìn)食良好，無死亡；吉西他濱組裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)2只，死亡1只；實(shí)驗(yàn)Ⅰ組裸鼠出現(xiàn)稀便3只，死亡1只。各組裸鼠移植瘤重量及抑瘤率：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死模型裸鼠后分離肝臟腫瘤并稱重，各組裸鼠肝臟移植瘤重見表1。與對(duì)照組比較，吉西他濱組、實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組瘤重均明顯減輕（P＜0.05），抑瘤率分別為79.2%、50.6%、59.3%和77.9%；實(shí)驗(yàn)Ⅲ組分別與實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；吉西他濱組與實(shí)驗(yàn)Ⅲ組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組腫瘤組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果：各組裸鼠肝臟腫瘤組織經(jīng)HE染色后鏡下觀察均證實(shí)為胰腺癌，其中吉西他濱組和實(shí)驗(yàn)Ⅰ組腫瘤組織中可見組織細(xì)胞片狀壞死，見圖1（封四）。

表1 各組裸鼠瘤重、抑瘤率比較（）

表1 各組裸鼠瘤重、抑瘤率比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組比較，△P＜0.05

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2.2大黃素脂質(zhì)體對(duì)裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤組織Ki-67和CD34表達(dá)的影響 Ki-67染色陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿不著色，胞核染成棕褐色，核固縮，染色質(zhì)濃聚，而CD34陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞膜為棕褐色。免疫組化結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組裸鼠腫瘤組織Ki-67和CD34陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）；吉西他濱組Ki-67陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組下降（P＜0.05），而CD34陽(yáng)性表達(dá)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與實(shí)驗(yàn)Ⅰ組比較，實(shí)驗(yàn)Ⅲ組Ki-67和CD34陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度明顯降低（P＜0.05），見表2，圖2（封四）。

表2 各組裸鼠腫瘤組織細(xì)胞Ki-67、CD34和TunelIOD值比較（）

表2 各組裸鼠腫瘤組織細(xì)胞Ki-67、CD34和TunelIOD值比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)Ⅲ組比較，▲P＜0.05

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2.3大黃素脂質(zhì)體對(duì)裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞凋亡的影響 Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為僅為胞核染成棕褐色。實(shí)驗(yàn)各組腫瘤組織切片中均可見凋亡細(xì)胞，吉西他濱組、實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組裸鼠腫瘤組織Tunel陽(yáng)性細(xì)胞的IOD值較對(duì)照組均明顯升高（P均＜0.05）；實(shí)驗(yàn)Ⅲ組Tunel陽(yáng)性細(xì)胞的IOD值顯著高于實(shí)驗(yàn)Ⅰ組（P＜0.05）。見表2，圖3（封四）。

表3 各組裸鼠腫瘤組織細(xì)胞MMP-2和MMP-9 IOD值比較（）

表3 各組裸鼠腫瘤組織細(xì)胞MMP-2和MMP-9 IOD值比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)Ⅲ組比較，△P＜0.05

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2.4大黃素脂質(zhì)體對(duì)裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響 Western印跡檢測(cè)結(jié)果表明，MMP-2、MMP-9和β-actin陽(yáng)性特異性條帶分別為72kDa、79kDa和43kDa；大黃素或大黃素脂質(zhì)體作用裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤模型后，均可抑制MMP-2和MMP-9在腫瘤組織細(xì)胞中的表達(dá)（P＜0.05），但吉西他濱組MMP-2和MMP-9表達(dá)強(qiáng)度與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組比較，實(shí)驗(yàn)Ⅲ組MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3，圖4（封四）。

3 討 論

大黃素是一種蒽醌類化合物，是大黃等中藥的有效成分，對(duì)包括胰腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用，且對(duì)機(jī)體毒副作用少[4-6]。而脂質(zhì)體作為一種藥物載體，因可避免藥物被內(nèi)皮細(xì)胞攝取而直接送入病灶并緩慢發(fā)揮作用，故可使所載藥物生物利用率增高、不良反應(yīng)減輕[7-8]，實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用均顯示較好的應(yīng)用前景。大黃素因具有強(qiáng)親脂性，制作成脂質(zhì)體的大黃素水溶性大大增加，可具良好的生理相容性[3]。因此，我們的研究力求證實(shí)大黃素對(duì)裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤的治療作用以及脂質(zhì)體作為大黃素載體的“減毒增效”作用，并初步探討其可能的機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，吉西他濱（100mg/kg）可明顯抑制裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)，而10mg/kg脂質(zhì)體大黃素也有較明顯的抑瘤作用，二者效果相當(dāng)，證實(shí)脂質(zhì)體大黃素抑制胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)的療效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，普通大黃素也可抑制胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)，但劑量為10mg/kg的大黃素的抑瘤率為50.6%，低于劑量為10mg/kg脂質(zhì)體大黃素的抑瘤效果，也低于劑量為5mg/kg脂質(zhì)體大黃素的抗腫瘤效應(yīng)，表明將大黃素制作成脂質(zhì)體給藥可增強(qiáng)其抗癌效應(yīng)。對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組化分析可知，脂質(zhì)體大黃素可明顯降低Ki-67在腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)，表明脂質(zhì)體大黃素能有效聚集于轉(zhuǎn)移瘤上，增加局部藥物濃度從而增強(qiáng)大黃素的抑瘤效應(yīng)。因此，本研究證實(shí)了大黃素對(duì)胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤的作用，也證實(shí)了脂質(zhì)體作為載體提高大黃素的抑瘤效果。

既往研究表明，大黃素抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方式以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為主，而非通過明顯的細(xì)胞毒性作用[9]。本研究過程中也可觀察到細(xì)胞毒性藥物吉西他濱作用裸鼠后出現(xiàn)稀便和食欲不振等明顯毒副作用，普通大黃素組裸鼠也有類似反應(yīng)，但較輕。而大黃素脂質(zhì)體作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后無一例出現(xiàn)明顯毒副作用，同時(shí)鏡下觀察大黃素脂質(zhì)體作用后腫瘤組織未見明顯組織壞死表現(xiàn)，表明脂質(zhì)體作為載體可降低所載藥物（本實(shí)驗(yàn)為大黃素）的毒性，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[7-8]。

腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制比較公認(rèn)的是三步驟學(xué)說[6]，即①分離：腫瘤細(xì)胞黏附能力下降，脫離原發(fā)病灶；②降解：癌細(xì)胞和局部宿主細(xì)胞分泌水解酶，水解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜中的蛋白成分；③移動(dòng)：癌細(xì)胞通過水解后形成的組織間隙向周圍浸潤(rùn)或進(jìn)入淋巴管、血管，向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。三個(gè)步驟涉及癌細(xì)胞與癌細(xì)胞，癌細(xì)胞與ECM，癌細(xì)胞與宿主細(xì)胞間的復(fù)雜的相互作用。癌細(xì)胞可產(chǎn)生和誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種蛋白酶降解ECM，促進(jìn)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是其中最為重要的一組。MMP-2和MMP-9在過度表達(dá)情況下能夠破壞基底膜和降解細(xì)胞外基質(zhì)中膠原和非膠原成分，使得腫瘤突破原發(fā)部位正?；啄げ⑾蛏顚咏?rùn)，且突破血管和淋巴管，造成腫瘤血行和淋巴轉(zhuǎn)移。同時(shí)MMP-9還可調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）[10]，促進(jìn)腫瘤血管生成。

因此，抑制MMP-2和MMP-9能有效抑制惡性腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和血管生長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)中，吉西他濱對(duì)腫瘤血管生長(zhǎng)以及對(duì)MMP-2和MMP-9表達(dá)無明顯影響（P＞0.05），而大黃素脂質(zhì)體不僅可有效抑制肝轉(zhuǎn)移瘤組織CD-34的表達(dá)，還可抑制MMP-2和MMP-9在體內(nèi)腫瘤中表達(dá)（P＜0.05），且較相同濃度大黃素明顯，表明大黃素脂質(zhì)體可能通過抑制MMP-2和MMP-9在胰腺癌組織表達(dá)，而有效抑制胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)。

綜上所述，大黃素脂質(zhì)體因具脂質(zhì)體藥物的生物利用率高和不良反應(yīng)輕的優(yōu)勢(shì)，在對(duì)裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移瘤模型進(jìn)行治療中取得比普通大黃素更好、與吉西他濱相當(dāng)?shù)寞熜?，但毒副作用較后兩者明顯減少，其抗腫瘤作用機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)有關(guān)。

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Inhibitory Effect of Emodin on Hepatic Metastasis of Human Pancreatic Carcinoma in Nude Mice

XU Xianchou1,WEN Peinan1,WANG Zhaohong2,LIU An,YANG Weiqing.1 Department of General Surgery,the People's Hospital of Pinguang,Pingyang(325400),China;2 Department of Surgery,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

ObjectiveTo investigate the anti-tumor effect of free emodin and liposome emodin on hepatic metastasis of human pancreatic carcinoma in nude mice.MethodsAfter the model of hepatic metastasis of human pancreatic carcinoma was established in mice,the mice were randomized into 5 groups（n=10）,receiving 10%glucose, gemcitabine（100 mg/kg）,free emodin（10 mg/kg）,and liposomal emodin（5 and 10 mg/kg）via spleen injection in each group.The hepatic metastatic foci of pancreatic tumor weight and inhibition rate were evaluated after the mice were sacrificed.Immunohistochemistry（IHC）was used to detect the positive expression of Ki-67 and CD34 in tumors.The Tunel test kit was used to explore cellular apoptosis in tumor tissue.Expression of MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blotting.ResultsAdministration of gemcitabine,liposomal emodin and free emodin significantly decreased tumor weight as compared to untreated controls（P＜0.05）;administration of liposomal emodin resulted in a substantial delay of tumor growth as compared to free emodin at the same dose（P＜0.05）,but did not result in a significant difference as compared to gemcitabine group（P＞0.05）.The positive expression of Ki-67 and CD34 in the tumors of liposomal emodin groups were significantly lower than those in control group（P＜0.05）.Apoptosis occurred more frequently in liposomal emodin group than in control group（P＜0.05）.ConclusionEmodin has the anti-tumor effect on hepatic metastasis of pancreatic tumor and the effect is more obvious in liposomal emodin than in free emodin.The underlying mechanism may partially be through down-regulation of MMP-2 and MMP-9.

mice；pancreatic neoplasm；neoplasm metastasis；emodin；liposomes

2013-10-10

浙江省溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.Y20110012）

徐賢綢，E-mail：xxc@pyhosp.com