亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態(tài)性與肺腺癌化療療效的關系

董翠梅 康馬飛 趙燕儀 林 靜 陶利英

作者單位：541001 桂林 桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤內科

臨床研究

亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態(tài)性與肺腺癌化療療效的關系

董翠梅 康馬飛 趙燕儀 林 靜 陶利英

作者單位：541001 桂林 桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤內科

目的 觀察肺腺癌患者亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因C677T多態(tài)性與化療療效的關系。方法 化療前抽取92例肺腺癌患者外周血液，用聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測MTHFR基因C677T多態(tài)性，并分析其與化療的療效關系。結果 92例肺腺癌患者中，MTHFR基因C677T野生型（CC）的分布為60.9%（56/92），純合突變型（TT）為14.1%（13/92），雜合突變型（CT）為25.0%（23/92）。一線化療方案使用培美曲塞/卡鉑的療效：野生型（CC）PR 20例，SD 19例，PD 17例，總有效率（ORR）為35.7%；純合突變型（TT）PR 2例，SD 7例，PD 4例，ORR為15.4%；雜合突變型（CT）SD 13例，PD 10例，ORR為0。CC型患者化療ORR顯著高于TT型和CT型者（P=0.001）。CC型與TT型/CT型患者的腫瘤進展時間（TTP）分別為6.2個月和4.7個月，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.023）。二線化療方案使用吉西他濱/奈達鉑或多西紫杉醇/奈達鉑的療效：CC型PR 2例，SD 5例，PD 10例；TT型SD 3例；CT型PR 1例，SD 2例，PD 7例，CC型與TT型/CT型患者的ORR比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=1.000）。結論 MTHFR基因C677T野生型（CC）肺腺癌患者可能是使用培美曲塞聯(lián)合卡鉑化療有效的人群。MTHFR基因C677T CC型患者的TTP顯著長于TT型患者和CT型患者。MTHFR基因C677T多態(tài)性與吉西他濱/奈達鉑或多西紫杉醇/奈達鉑化療療效無關。

肺腫瘤；非小細胞肺癌；亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態(tài)性；化療療效

亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是葉酸代謝過程的關鍵酶，參與嘌呤和嘧啶的合成及DNA修復。培美曲塞聯(lián)合鉑類是治療肺腺癌的一線選擇，其他含鉑雙藥聯(lián)合方案也可在治療肺腺癌中使用，但其化療療效是否與MTHFR基因多態(tài)性有關尚不清楚。本研究觀察肺腺癌患者MTHFR基因C677T多態(tài)性與培美曲塞聯(lián)合卡鉑一線化療方案及吉西他濱聯(lián)合奈達鉑或多西紫杉醇聯(lián)合奈達鉑二線化療方案的有效率（RR）和腫瘤進展時間（TTP）的關系?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2011年9月至2013年2月經病理確診的Ⅲb/Ⅳ期肺腺癌患者92例，男性38例，女性54例，年齡為40～76歲，中位年齡57歲。化療前取全血標本提取DNA，使用聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測MTHFR基因C677T多態(tài)性，并觀察患者化療的有效率（RR）和腫瘤進展時間（TTP）。一線化療方案為培美曲塞500 mg/m2，d1；卡鉑AUC=5，d1，每21 d為1個周期，每2個周期末予CT掃描檢查評價療效1次。腫瘤進展者改用二線方案化療，吉西他濱1 000 mg/m2，d1、d8；奈達鉑80 mg/m2，d1或多西紫杉醇75 mg/m2，d1；奈達鉑80 mg/m2，d1或分子靶向藥物治療，腫瘤縮小或穩(wěn)定者繼續(xù)用藥，最多用6個周期。無進展者繼續(xù)用培美曲塞單藥維持治療，直到腫瘤進展為止。所有患者均簽署《知情同意書》，所用藥物均為同一廠家生產。

1.2 療效判斷標準

按“RECIST 1.1標準”進行療效評價。分為完全緩解（CR）：所有靶病灶全部消失。部分緩解（PR）：所有靶病灶的長徑總和縮小30%或以上。穩(wěn)定（SD）：腫瘤長徑變化介于PR和PD之間。進展（PD）：所有靶病灶的長徑總和增加20%以上，或出現(xiàn)新病灶?？傆行剩∣RR）（%）=CR+PR/（CR+PR+SD+PD）×100%。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本的采集 化療前抽取患者靜脈血液2 ml于EDTA抗凝管中，用全血DNA提取試劑盒提取基因組DNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA的提取 ①取200 μl全血放入1.5 ml離心管中，加入20 μg蛋白酶K（20 mg/ml）溶液，充分混勻，再加入200 μl結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置10 min，冷卻后加入100 μl異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀（如樣品黏稠不易混勻時可以渦旋振蕩15 s混勻）。②將以上混合物（包括可能有的沉淀物）加入一條吸附柱AC中，將吸附柱放入收集管中以13 000 r/min離心30～60 s，棄去廢液。③加入500 μl抑制物去除液IR，以12 000 r/min離心30 s，棄去廢液。④加入700 μl漂洗液WB，以12 000 r/min離心30 s，棄掉廢液。⑤加入500 μl漂洗液WB，以12 000 r/min離心30 s，棄掉廢液。⑥將吸附柱AC放回收集管中，以13 000 r/min離心2 min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。⑦取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100 μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65～70℃水浴中預熱效果更好），室溫放置3～5 min，以12 000 r/min離心1 min。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2 min，以12 000 r/min離心1 min。收集DNA溶液，置-20℃冰箱保存。

1.3.3 MTHFR基因C677T多態(tài)性的檢測 應用Primer Premier 5.0軟件設計引物，所有引物由Invitrogen Custom Primers公司合成。MTHFR基因C677T PCR引物序列如下：上游引物為5′-TCA TCC CTA TTG GCA GGT TAC-3′，下游引物為5′-CAG CGA ACT CAG CAC TCC AC-3′。PCR擴增反應體系：模板DNA 3 μl，上、下游引物各 0.5 μl，2×Master Mix12.5 μl，ddH2O補足到25 μl。PCR反應條件為94℃預變性5 min，然后94℃30 s、59℃30 s、72℃45 s，共35個循環(huán)，再予72℃延伸7 min。取PCR擴增產物5 μl加入1 μl 10×loading Buffer，混勻后點樣在2%的瓊脂糖凝膠上。以100 v恒壓電泳35 min，在紫外燈下與100 bp DNA Marker對照，如出現(xiàn)有309 bp的目的條帶則進行酶切反應。酶切反應體系：去離子水17 μl，PCR產物10 μl，10×Fast Digest Buffer 2 μl，快速酶切酶1 μl，混勻，離心，置于37℃水浴中5 min。取酶切產物5 μl，加入1 μl 6×loading Buffer，混勻后在4%的瓊脂糖凝膠上點樣。100 v恒壓電泳35 min，用溴乙錠染色該酶切片段，然后在4%（p/v）的瓊脂糖凝膠電泳顯影，可觀察到MTHFR C677T 3種類型的條帶為CC：309 bp；CT：309 bp，214 bp，95 bp；TT：214 bp，95 bp。

1.4 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 19.0軟件處理分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料的差別比較用χ2檢驗或Fisher精確概率法。計量資料的比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTHFR基因C677T多態(tài)性分布

MTHFR基因C677T多態(tài)性經酶切電泳顯示3種條帶，其野生型（CC）為309 bp，純合突變型（TT）為214 bp和95 bp；雜合突變型（CT）為309 bp、214 bp和95 bp。圖1。野生型（CC）占60.9%（56/92）；純合突變型（TT）占14.1%（13/92）；雜合突變型（CT）占25.0%（23/92）。

圖1 MTHFR基因C677T多態(tài)性的酶切電泳圖注：M.Marker；3、4、6.野生型（CC）309 bp條帶；1.純合突變型（TT）214 bp和95 bp條帶；2、5.雜合突變型（CT）309 bp、214 bp和95 bp條帶。

2.2 MTHFR基因C677T多態(tài)性與一線化療方案化療后ORR和TTP的關系

化療后野生型（CC）PR 20例，SD 19例，PD 17例，ORR為35.7%；純合突變型（TT）PR 2例，SD 7例，PD 4例，ORR為15.4%；雜合突變型（CT）SD 13例，PD 10例，ORR為0。CC型和TT型/CT型患者的ORR比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.954，P=0.001）。CC型和TT型/CT型患者的TTP分別為6.2個月和4.7個月，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.312，P=0.023）。

2.3 MTHFR基因C677T多態(tài)性與二線化療方案化療后ORR和TTP的關系

17例野生型（CC）進展者，二線化療方案使用吉西他濱（GEM）/奈達鉑（NDP）方案化療10例，結果PR 1例，SD 3例，PD 6例，ORR為10.0%。使用多西紫杉醇（DOC）/NDP方案者7例，結果PR 1例，SD 2例，PD 4例，ORR為14.3%。4例純合突變型（TT）進展者，除1例改用吉非替尼外，3例用二線方案化療，使用GEM/NDP方案化療者2例，結果SD 2例，ORR為0。使用DOC/NDP方案者1例，SD 1例，ORR為0。10例雜合突變型（CT）進展者，二線使用GEM/NDP方案化療5例，結果PR 1例，SD 1例，PD 3例，ORR為20.0%。使用DOC/NDP方案化療5例，SD 1例，PD 4例，ORR為0。CC型與TT型/CT型患者的ORR比較，經Fisher精確概率法檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P=1.000）。CC型和TT型/CT型患者的TTP分別為2.3個月和2.1個月，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.588，P=0.568）。

3 討論

MTHFR基因位于1號染色體短臂上（1p36．3），包括11個外顯子和10個內含子，cDNA全長為2.2kb。MTHFR基因是機體一碳基團代謝關鍵酶，也是甲硫氨酸代謝中的關鍵酶。目前已發(fā)現(xiàn)MTHFR基因有近20個基因突變位點，其中部分多態(tài)位點的錯義突變是導致酶活性降低、缺失和（或）熱穩(wěn)定性改變的主要機制。目前研究報道較多且與人類疾病關系較大的多態(tài)位點是C677T和A1298C。C677C→T是MTHFR最常見的突變，主要引起酶活性下降和熱穩(wěn)定性的改變。由于MTHFR基因的活性降低，抑制了5-甲基四氫葉酸形成的通路，從而增進DNA合成并減少DNA損傷的風險。

在MTHFR基因C677T多態(tài)性分布方面，有研究顯示，在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）病例中，MTHFR基因C677T C/C型、C/T型和T/T型的頻度分別為34.0%、50.5%和15.5%［1］，廣東地區(qū)漢族NSCLC患者MTHFR基因C677T C/C型、C/T型和T/T型的頻度分別為24.0%、52.0%和24.0%［2］。本研究結果顯示，在肺腺癌中，MTHFR基因C677T C/C型、C/T型和T/T型的頻度分別為60.9%、25.0%和14.1%，與其他研究的基因型分布不一致，分析是否存在不同病理類型之間差異或地區(qū)、民族之間的差異，有待進一步研究。

在MTHFR基因C677T多態(tài)性與化療療效關系方面，有研究觀察MTHFR基因C677T多態(tài)性與乳腺癌患者化療敏感性的關系。結果顯示，MTHFR基因C677T的T/T型患者的化療有效率（87.5%）顯著高于C/C型患者（52.4%），在CAF方案化療組患者中，MTHFR基因C677T的T/T型、T/C型患者的化療有效率（90.0%、68.8%）顯著高于C/C型患者（30.8%），認為MTHFR基因C677T多態(tài)性對指導乳腺癌個體化治療具有較高的應用價值［3］。但是，在一項NSCLC研究中，未發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T多態(tài)性與NSCLC化療的療效有明顯關系。而聯(lián)合分析MTHFR基因C677T多態(tài)性A1298C多態(tài)基因型與化療療效的關系時，發(fā)現(xiàn)攜帶MTHFR基因C677T的T等位基因（C/T型或T/T型）、同時攜帶A1298C A/A型者的化療有效率為51.1%，顯著高于同時攜帶C677T的C/T型及A1298C的C等位基因者（12.5%）［1］。Argiris等［4，5］在使用培美曲塞聯(lián)合西妥昔單抗或貝伐單抗治療頭頸癌時，發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性與化療毒性和療效的關系不明顯。但本研究結果顯示，攜帶C677T基因野生型（CC）者ORR為35.7%，純合突變型（TT）ORR為15.4%，雜合突變型（CT）無有效病例。CC型患者的療效顯著高于TT型和CT型者，考慮攜帶MTHFR基因C677T野生型（CC）的肺腺癌患者可能是使用培美曲塞聯(lián)合卡鉑化療有效的優(yōu)勢人群。二線使用GEM/NDP和DOC/NDP方案者，化療有效率無差別，考慮MTHFR基因C677T多態(tài)性與GEM或DOC的含鉑兩藥方案的療效可能無關，但該研究病例數(shù)太少，有待于進一步研究。

有研究顯示，具有MTHFR基因C677T的TT型肺癌患者使用含培美曲塞方案治療后的無腫瘤進展生存期（PFS）和總生存期（OS）顯著長于含CC型、CT型患者，認為MTHFR基因C667T多態(tài)性可預測培美曲塞治療肺癌患者生存期的差別［6，7］。本研究結果顯示，具有MTHFR基因C677T CC型患者使用培美曲塞聯(lián)合卡鉑方案治療后的TTP顯著長于TT型和CT型者。Alberola等［8］的研究結果認為具有MTHFR基因C677T CC型患者使用吉西他濱聯(lián)合順鉑治療后的TTP顯著長于TT型和CT型者，而本研究顯示MTHFR基因C677T多態(tài)性與GEM或DOC含鉑類兩藥方案的TTP可能無關。

綜上，本研究結果顯示，具有MTHFR基因C677T野生型（CC）多態(tài)的肺腺癌患者可能是使用培美曲塞聯(lián)合卡鉑化療有效的優(yōu)勢人群，具有MTHFR基因C677T CC型患者的化療療效顯著高于TT型和CT型者，TTP顯著長于TT型和CT型者。MTHFR基因C677T多態(tài)性與吉西他濱/奈達鉑或多西紫杉醇/奈達鉑化療療效無關。

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［2013-07-19收稿］［2013-09-30修回］［編輯 阮萃才］

Correlation of methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR）C677T polymorphism and chemotherapy efficacy in lung adenocarcinoma

DONG Cui-mei，KANG Ma-fei，ZHAO Yan-yi，LI Jing，TAO Li-ying（Department of Medical Oncology，Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541001，P.R.China）

Objective To investigate a possible correlation between C677T polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR）gene and chemotherapy efficacy in patients with pulmonary adenocarcinoma.Methods Peripheral blood samples from 92 patients with pulmonary adenocarcinoma were collected before chemotherapy，and the C677T polymorphism was genotyped using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）.We examined whether genotype correlated with whether the patients showed partial response（PR），stable disease（SD）or progressive disease（PD）following chemotherapy.Results Of the 92 patients，56（60.9%）had wild-type genotype（CC），13（14.1%）were homozygous mutant（TT），and 23（25.0%）were heterozygous mutant（CT）.Among the patients treated with pemetrexed/carpoplatin as first-line regimen，CC patients showed an overall response rate（ORR）of 35.7%，with 20 CC patients achieving PR；19，SD；and 17，PD.Among TT patients，ORR was 15.4%，with 2 patients achieving PR；7，SD；and 4，PD.Among CT patients，ORR was 0，with 13 achieving SD and 10，PD.ORR was significantly higher in CC patients than in TT or CT patients（P=0.001）.In addition，CC patients showed significantly longer time to progression（6.2 months）than did TT or CT patients（4.7 months；P=0.023）.Among the patients treated with gemcitabine/nedaplatin or docetaxel/ nedaplatin as second-line regimen，2 CC patients showed PR；5，SD；and 10，PD.3 TT patients achieved SD；among CT patients，1 achieved PR，2 SD and 7，PD.ORR was similar between CC and TT/CT patients（P=1.000）.Conclusions Pemetrexed in combination with carboplatin may be associated with greater therapeutic efficacy and longer time to progression in CC patients than in TT/CT patients.However，genotype at the MTHFR C677T polymorphism does not appear to influence the therapeutic efficacy of gemcitabine/ nedaplatin or docetaxel/nedaplatin.

Lung neoplasms；Non-small cell lung cancer；Methylenetetrahydrofolate reductase；Gene polymorphism；Chemotherapy

R734.2

A

1674-5671（2014）01-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.08

廣西衛(wèi)生廳自籌科研課題（Z2012426）

康馬飛。E-mail：kmfgl@163.com