聚乙二醇共價修飾藥用蛋白質的分析方法實際應用研究

田學軍

【摘 要】目的：分析聚乙二醇共價修飾藥用蛋白質的分析方法，了解其生物意義。方法：本組主要對2011年7月至2013年7月期間聚乙二醇共價修飾藥用蛋白質生物價值的研究資料作回顧分析。結果：液相色譜方法、電泳方法、分光光度法等較為常用，能夠清楚地了解到聚乙二醇對蛋白質表面自由氨基的修復作用。結論：采用聚乙二醇共價修飾藥用蛋白質，有利于降低使用藥用蛋白治療出現(xiàn)不良用藥癥狀，提高臨床療效。

【關鍵詞】聚乙二醇 液相色譜方法 電泳方法 分光光度法

聚乙二醇（polyethylene glycol ，PEG ）為高分子化合物，親水性強、水動力體積大、無免疫原性，可通過對藥用蛋白修飾作用促使藥物水中溶解及生物分配特性變化、抑制酶解、促使空間屏障的產(chǎn)生，提升藥物作用效果[1]。為了解PEG修飾藥用蛋白的特點，本文對2011年7月至2013年7月期間聚乙二醇共價修飾藥用蛋白質生物價值的研究資料作回顧分析，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

整理分析2011年7月至2013年7月期間聚乙二醇共價修飾藥用蛋白質生物價值的研究資料。

1.2方法

結合近年來關于聚乙二醇共價修飾藥用蛋白質生物價值的研究資料，對PEG共價修飾藥用蛋白分析領域的液相色譜法、分光光度法及電泳法等特點及臨床價值進行研究分析[2]。

1.3觀察指標

觀察不同修飾分析方法下的蛋白修飾度、特定位點修飾程度、偶聯(lián)不同PEG數(shù)量的蛋白相對含量。

1.4臨床價值評定

分析不同修飾分析方法難度及可操作性，以了解不同修飾分析方法的臨床價值[3]。

1.5統(tǒng)計學分析

本次數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件對本研究的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學的分析，計數(shù)資料的對比應用卡方檢驗，而計量資料的對比應用t檢驗，P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

液相色譜方法、電泳方法、分光光度法為PEG共價修飾藥用蛋白常見分析手段：

2.1 分光光度法應用

此種分析方法源于20世紀70年代中期，由于三硝基苯磺酸和存在于蛋白表層的賴氨酸反應所產(chǎn)生的三硝基苯衍生物可被有選擇地吸收，從而可以計算出蛋白質有多少數(shù)量的自由氨基，PEG共價修飾藥用蛋白會使自由氨基在蛋白表面分布量減少，利用三硝基苯磺酸與蛋白質的反應可了解誒PEG修飾蛋白效果。此種分析法多用于對PEG修飾蛋白平均修飾度的研究中較為廣泛，但此種分析法操作中容易被沒有發(fā)生反應的PEG分析造成干擾，因而準確性一般，近年來對三硝基苯磺酸反應的改善和甘氨酸對照方案的應用，不僅使得操作程序更簡單便捷，分析準確度也明顯改善[4]。

2.2 液相色譜法應用

有學者以分子尺寸排阻色譜將PEG所修飾白細胞介素-2分離處理，以測定得出不同分離峰的紫外折光系數(shù)、吸收值，并根據(jù)兩個參數(shù)比值大小測算PEG所修飾的蛋白組分水力學半徑、重量分數(shù)以及修飾度數(shù)據(jù)；也有學者采用C14反相高效液相色譜對修飾SOD以及沒有修飾的SOD蛋白分離處理，或對PEG修飾的生長激素拮抗劑以離子交換色譜分析測定，各類色譜法分析過程中始終難以得到滿意的分辨率，而且有較寬的譜帶擴展，若分析樣品內(nèi)有PEG存在，就會直接對色譜特點造成干擾，減少色譜內(nèi)球狀蛋白表觀分子含量，測定結果也有首影響。因而，液相色譜法分析難度受PEG存在與否決定，此種分析法制備分離力更佳，所以一直受到廣泛應用。

2.3 電泳法應用

對分子量不同的PEG修飾的藥用蛋白以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離處理和分析觀察效果滿意，此種分析法會因修飾的蛋白考馬斯亮蘭染色效果變化而存在不足，臨床研究一直致力于糾正這一缺陷，近年來的一些臨床工作者在電泳處理后對存在于蛋白表層的一些聚乙二醇予以碘化鋇染液處理、以考馬斯亮藍染色，此法PEG水力學半徑相對大而使蛋白物質電泳遷移較慢、分離不徹底，因而最終所得表觀分子量有偏差。另有研究采用電聚焦電泳法予以分析，此種分析法分辨率不足。近年來盛行的毛細管電泳得到了滿意的生物大分子分析效果，在PEG修飾蛋白定量分析、定性分析領域效果均良好，有學者以改性劑使正電荷存在于毛細管柱之內(nèi)，電滲流方向發(fā)生改變；另有學者以大分子量的聚氧乙烯動態(tài)涂柱毛細管電泳發(fā)對蛋白修飾度進行分析，可分離出不同偶聯(lián)SOD蛋白峰，對其定量分析所得結果十分精準。多數(shù)資料表示，近年來得到推廣的線形聚丙烯酰胺靜態(tài)涂柱毛細管電泳法分析藥用血紅蛋白修飾效果良好。

3討論

PEG共價修飾蛋白質的研究在近幾十年來很多，這是由于PEG修飾的一些藥用蛋白性質會發(fā)生有利改變，從而受到更好的臨床治療效果。例如，PEG共價修飾的藥用蛋白進入機體后血藥半衰期得到延長、異源蛋白引發(fā)的免疫排斥反應發(fā)生率更低、蛋白在人體內(nèi)有更高的溶解度、蛋白天然活性得到很好的保持[5]。20世紀90年代初期，以PEG修飾的藥用蛋白PEG-腺苷脫氨酶首次經(jīng)美國藥品與食品管理局批準上市，真正投入到臨床治療中，對嚴重兒童免疫系統(tǒng)缺陷病治療效果滿意。之后，Cetus、Enzon等全球知名藥品生產(chǎn)商陸續(xù)推進PEG修飾藥用蛋白技術的進展。經(jīng)過多年的臨床研究、實踐應用，越來越多的PEG應用于醫(yī)學臨床藥用蛋白共價修飾中，常見的產(chǎn)物有白細胞介素-2（IL-2）、牛血清白蛋白（BSA）、牛超氧化物歧化酶（SOD）、人粒細胞集落刺激因子（GM-CSF）等。

PEG種類較多，研究中常用的為一種一端封閉的單甲氧基聚乙醇5000分子，使用此種物質選擇性對單邊質分子中賴氨酸側鏈的氨基結構進行修飾，PEG末端醇羥基沒有活潑的化學性質，因而需要與N-羥基琥珀酰亞胺及三氯均氰等物質反應以達到活化的目的，經(jīng)反應的PEG與蛋白表面N末端氨基更易發(fā)生共價結合而形成性質穩(wěn)定的尿烷鍵、酰胺鍵。但是，常用以對蛋白質進行修飾的PEG分子有特殊的分子量分布特點，有國外相關研究提出，MPEC5000分子量是5000±250道爾頓，可見，即便一類蛋白質分子中有相同數(shù)量的PEG，也不一定有同樣的分子量。而且，藥用蛋白表面通常有較多的可修飾氨基位點，不同的氨基殘疾與PEG分子相結合就會形成多種復雜的修飾蛋白空間結構。PEG和藥用蛋白修飾結合生成的是混合物，即便以同等修飾度的蛋白分子與PEG結合，也難以避免因多種修飾位點的影響而出現(xiàn)修飾結果的多態(tài)性。正是因為這種復雜的、難以掌握的多態(tài)性的出現(xiàn)，給臨床上準確分析PEG修飾藥用蛋白的準確度造成了困難。

采用聚乙二醇共價修飾藥用蛋白質，有利于降低使用藥用蛋白治療出現(xiàn)不良用藥癥狀，提高臨床療效。當前臨床高度認可PEG修飾藥用蛋白臨床價值，認為此種技術可同時縮短疾病治療時間、提升臨床療效。PEG修飾技術發(fā)展至今，已有十余種相關蛋白藥物在臨床得到應用和推廣，由于PEG修飾蛋白技術及分析方法尚不成熟，臨床上還有很多相關藥物因未得到滿意的修飾效果而不能投入使用，臨床工作者應加大PEG修飾蛋白技術的研究與開發(fā)，充分使用液相色譜方法、電泳方法、分光光度法等PEG修飾藥用蛋白分析手段，促進多點隨機修飾技術逐漸向更加成熟的定點修飾方向發(fā)展、從相對復雜的操作模式向集成化的現(xiàn)代化操作方向改進，進一步改善藥用蛋白生物活性，并同時降低技術成本，真正實現(xiàn)其臨床價值[6]。

【參考文獻】

[1]肖錫峰，江小群，周雷激等.聚乙二醇表面改性抑制蛋白質非特異性吸附[J].分析化學，2013，41（3）：445-453.

[2]沈濤，阮楊，丁鈴等.聚乙二醇-過氧化氫酶在小鼠心肌肥厚和損傷中的保護作用[J].中國心血管雜志，2013，18（2）：111-115.

[3]張永國.蛋白質的PEG修飾[J].海峽藥學，2013，25（1）：14-18.

[4]路娟，劉清飛，羅國安等.藥物的聚乙二醇修飾研究進展[J].有機化學，2009，29（8）：1167-1174.

[5]董紅霞，童玥，錢曉暐等.聚乙二醇化蛋白質多肽類藥物定點修飾策略[J].藥學與臨床研究，2013，21（4）：360-365.

[6]楊旭，貢濟宇.蛋白多肽類藥物聚乙二醇化修飾研究進展[J].中國當代醫(yī)藥，2012，19（31）：16-17，20.endprint