Graves病動(dòng)物模型干預(yù)模式的探討

葉 楓，伍麗萍，侯 鵬，馬曉丹，高 雷，徐 利，吳曉燕，施秉銀

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，湖北武漢 430030；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西西安 710061)

動(dòng)物模型在疾病的發(fā)病機(jī)制、治療等領(lǐng)域的研究中占有不可替代的地位。經(jīng)過近半個(gè)世紀(jì)的探索，目前比較公認(rèn)的毒性彌漫性甲狀腺腫(Graves病)動(dòng)物模型是由美國加州大學(xué)提出的，用表達(dá)促甲狀腺激素受體(thyrotropin receptor, TSHR)A亞單位的重組腺病毒免疫雌性BALB/c小鼠所形成[1-2]。該模型的特點(diǎn)主要有甲狀腺腫大、血清促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)以及總甲狀腺素(TT4)水平增高、甲狀腺組織病理符合甲亢表現(xiàn)等。雖然該模型已廣泛應(yīng)用于Graves病的研究，而且均采用Ad-TSHR289股四頭肌注射，但造模時(shí)間及免疫次數(shù)各家報(bào)道不一[3-12]。因此，本研究的目的主要是探討Graves病動(dòng)物模型的最佳干預(yù)模式。

1材料與方法

1.1重組腺病毒的構(gòu)建經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩選得到的重組質(zhì)粒pDC316-TSHR289，與重組腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxdel E13cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，出現(xiàn)噬斑后凍溶細(xì)胞3次，收集上清，經(jīng)鑒定正確后接種293細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增，用陰離子交換柱層析純化，經(jīng)典方法測定其腺病毒感染性滴度(TCID)值，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2動(dòng)物免疫45只BALB/c小鼠分為4組：5周-對(duì)照組(7只)、5周-造模組(16只)，10周-對(duì)照組(10只)、10周-造模組(12只)，分別用50 μL包含有1×109顆粒的Ad-Lacz或Ad-TSHR289的PBS經(jīng)股四頭肌注射，每隔3周免疫1次，5周-對(duì)照組以及5周-造模組小鼠于第2次免疫后2周處死，10周-對(duì)照組及10周-造模組小鼠于第3次免疫后4周處死。

所有小鼠均采取摘眼球取血，檢測血清TRAb、TT4；剝離甲狀腺，做組織學(xué)檢查(實(shí)驗(yàn)分兩次進(jìn)行)。

1.3小鼠血清TRAb、TT4的測定以放射免疫法(RIA)進(jìn)行測定，TRAb放射免疫試劑盒購自德國Medipan公司，TT4放射免疫分析藥盒購自北京原子高科核技術(shù)應(yīng)用股份有限公司。

1.4甲狀腺組織病理學(xué)檢查小鼠處死后，分離甲狀腺，40 mL/L甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，組間發(fā)病率差異采用Fisher確切概率法；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)；一致性采用Kappa檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

圖1 5周-對(duì)照組、5周-造模組、10周-對(duì)照組、10周-造模組血清TT4水平的變化

2.3甲狀腺組織學(xué)檢查結(jié)果對(duì)照組所有小鼠光鏡下甲狀腺濾泡大小較均一，細(xì)胞排列比較疏松，上皮細(xì)胞呈低立方狀或扁平狀，濾泡中膠質(zhì)含量豐富；造模組部分小鼠肉眼下甲狀腺組織明顯增大，光鏡下，表現(xiàn)為甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增生肥大，呈立方狀或高柱狀，濾泡腔中膠質(zhì)含量減少或缺失，部分小鼠有乳頭狀增生；所有小鼠甲狀腺組織均未見淋巴細(xì)胞侵潤；10周-造模組相對(duì)于5周-造模組甲狀腺組織學(xué)改變更明顯(圖3)。

進(jìn)一步探討所有通過TT4判定為甲亢的小鼠是否均有甲狀腺組織學(xué)改變。在10周-造模組中(圖4B)，所有甲亢小鼠均有甲狀腺組織學(xué)改變，而甲功正常的小鼠均未見明顯的甲狀腺組織學(xué)改變；在5周-造模組(圖4A)，5只甲亢小鼠及4只甲功正常的小鼠可見甲狀腺組織學(xué)改變；10周-造模組甲狀腺組織學(xué)改變與TT4吻合度為100%，相對(duì)于5周-造模組的50%(8/16)明顯升高。分析血清TT4水平與甲狀腺組織學(xué)改變的相關(guān)性，結(jié)果表明，10周-造模組甲狀腺組織學(xué)改變與血清TT4水平成明顯正相關(guān)(r=0.753，P=0.005)，而5周-造模組無明顯相關(guān)性(r=-0.014，P=0.960)。

圖2 血清TRAb水平(A)及5周-造模組和10周-造模組小鼠血清TT4與TRAb相關(guān)性分析(B)

圖3 正常組(A～C)、5周-甲亢組(D～F)和10周-甲亢組(G～I(xiàn))小鼠甲狀腺組織的光鏡檢查

圖4 5周-造模組、10周-造模組小鼠甲狀腺功能及組織學(xué)改變吻合度分析

3討論

自20世紀(jì)90年代以來，人們嘗試各種方式制造Graves病動(dòng)物模型，包括體內(nèi)注射hTSHR cDNA、重組腺病毒表達(dá)的TSHR或應(yīng)用甲狀腺刺激性抗體(TSAb)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型等。經(jīng)過20年探索，目前使用最廣泛的是Ad-TSHR289誘導(dǎo)的Graves病模型。但不同國家的研究者采取的終點(diǎn)時(shí)間并不一致，從2次免疫后2周到3次免疫后8周不等[3-12]，大多集中在2次免疫后2周[6-9]以及3次免疫后4周[2,10-12]。本研究在我們既往實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，主要探討時(shí)間和免疫次數(shù)對(duì)該模型的影響，確定最佳造模方案，為進(jìn)一步利用該模型進(jìn)行相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

我們既往用Ad-TSHR289免疫雌性近交系BALB/c小鼠，于3次免疫后8周(14周造模)處死小鼠[13]，結(jié)果僅有30%(3/10)的小鼠發(fā)生甲亢，而10周-造模組甲亢發(fā)病率為75%，與報(bào)道的65%～80%一致，這兩次實(shí)驗(yàn)除造模時(shí)間不一致外，其余條件基本相同(包括小鼠品種、性別、年齡、注射部位、病毒劑量以及免疫次數(shù)等)。因此，認(rèn)為造模時(shí)間對(duì)GD模型的發(fā)病率有影響。CHEN等[3]早期建模時(shí)也發(fā)現(xiàn)了10周-造模組發(fā)病率高于14周，并提到TT4水平在第3次免疫后有可能不增反減。我們認(rèn)為出現(xiàn)這種結(jié)果可能與腺病毒表達(dá)時(shí)間短暫[14-15]而TT4的半衰期又較短有關(guān)。雖然腺病毒對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，但它在體內(nèi)的表達(dá)時(shí)間相對(duì)較短，而且不能復(fù)制，也不能隨著有絲分裂而分裂，最重要的是，它很容易誘發(fā)體內(nèi)針對(duì)載體及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)，使其不斷被稀釋，感染滴度也逐漸下降[14-15]。因此，在第3次免疫后隨著腺病毒感染力度的下降，血清TT4水平也逐漸下降，而TT4在體內(nèi)的半衰期又相對(duì)較短，腺病毒的作用一旦下降，TT4也會(huì)跟著迅速下降，所以就有可能出現(xiàn)TT4水平隨著時(shí)間的延長不增反減的現(xiàn)象，導(dǎo)致14周-造模組發(fā)病率小于10周。

本實(shí)驗(yàn)5周-造模組發(fā)病率為56%，較報(bào)道的60%～61%略低。10周-造模組發(fā)病率高于5周可能意味著3次免疫比2次免疫更容易誘發(fā)甲亢。因?yàn)?次病毒注射的免疫原性較2次肯定更強(qiáng)，當(dāng)然也不排除腺病毒在體內(nèi)注射后4周達(dá)到作用高峰的可能性，如果能加一組8周-造模組(免疫3次后2周處死小鼠)也許可以更好地說明免疫次數(shù)對(duì)該模型的影響。SAITOHS[4]研究即采取3次免疫后2周處死小鼠，模型的發(fā)病率為70%，在一定程度上支持了我們的假設(shè)。而CHEN等[3]通過比較10周-造模組和4周-造模組(2次免疫后1周)發(fā)現(xiàn)TT4水平在第3次免疫后有可能不增反減。故推測可能免疫次數(shù)以及造模時(shí)間均對(duì)Graves病發(fā)病率有重要影響，如果增加免疫次數(shù)的作用大于延長造模時(shí)間的作用，那么發(fā)病率就會(huì)增加(10周-造模組>5周-造模組)，反之，則降低(5周-造模組>14周-造模組)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，TRAb在所有的5周-或10周-造模組小鼠中均明顯升高，而且血清TRAb與TT4無明顯相關(guān)性。這與CHEN等[2]的研究結(jié)果一致，認(rèn)為TRAb對(duì)預(yù)示甲亢活動(dòng)以及甲亢嚴(yán)重程度的意義有限。

此外，還發(fā)現(xiàn)10周-造模組小鼠血清TT4水平與甲狀腺組織學(xué)改變成正相關(guān)，而且所有TT4升高達(dá)到甲亢判斷標(biāo)準(zhǔn)的小鼠均有甲狀腺組織學(xué)改變，而沒有達(dá)到判斷標(biāo)準(zhǔn)的無明顯組織學(xué)改變，其判斷甲亢的一致性為100%，較5周-造模組明顯升高(50%)，而且10周-造模組甲亢小鼠的甲狀腺組織學(xué)改變較5周-造模組更明顯。分析可能由于組織學(xué)改變無論是從正常到異常還是異常到正常均較血清學(xué)改變需要更多的時(shí)間[2]，而10周-造模組免疫原性增強(qiáng)、造模時(shí)間延長，更能滿足組織學(xué)改變的需要，這與CHEN等[2]的甲狀腺組織學(xué)改變是一種“延遲現(xiàn)象”的理論不謀而合。這也可以解釋為什么14周-造模組有1只甲功正常的小鼠甲狀腺組織學(xué)有改變。但是，5周-造模組有4只甲功正常的小鼠有組織學(xué)改變，這雖然可進(jìn)一步闡明5周-造模組小鼠血清TT4水平與甲狀腺組織學(xué)改變?nèi)鄙傧嚓P(guān)性，但是卻無法利用上面的理論解釋該現(xiàn)象，除了考慮生長刺激性免疫球蛋白可能會(huì)引起甲狀腺腫[16]以及5周-造模組小鼠血清TT4穩(wěn)定性差等因素外，可能還有某些我們尚未研究的因素在起作用，需要進(jìn)一步探討。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)10周-造模組相對(duì)于5周-造模組具有發(fā)病率高、組織學(xué)改變與血清TT4水平吻合度高以及組織學(xué)改變更明顯等優(yōu)勢，更適用于實(shí)驗(yàn)研究，另外造模時(shí)間以及免疫次數(shù)均對(duì)該模型有著較大的影響。

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