人甲狀腺未分化癌雞胚尿囊膜移植瘤模型的建立及生物學性狀

楊 琦，白艷霞，閆利英，王全穎，楊廣笑

(1.西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，陜西西安 710061；2.西安華廣生物科技有限公司，陜西西安 710025)

甲狀腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma, ATC)是惡性程度最高的甲狀腺癌，致死率極高[1-2]，極易侵犯鄰近組織，早期即可通過血管和淋巴管發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[3]，多數(shù)患者就診時腫瘤組織已擴展至甲狀腺外[4]。ATC的生存期較短，無論是手術治療還是放療化療，其生存期一般低于6個月[5]。目前為止，還未有任何簡單的動物模型應用于ATC的研究中。因此，建立ATC動物模型，探討其形態(tài)學特征及生物學特征，尋求有效的治療方法，十分重要。本研究擬用人ATC細胞株FRO，在雞胚尿囊膜(CAM)上建立ATC移植瘤模型，并初步探討移植瘤形成條件，觀察移植瘤形態(tài)學特征與生物學特征，為ATC的進一步研究提供簡便的動物模型。

1材料與方法

1.1人甲狀腺未分化癌標本來源收集2007～2011年西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科ATC患者的手術切除標本11例。所有標本均經(jīng)100 mL/L甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，每例均制成5 μm厚的切片，行HE染色。

1.2細胞培養(yǎng)人ATC細胞株FRO由重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院劉智敏教授惠贈。人ATC細胞株FRO在含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37 ℃、50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)，待細胞達到一定數(shù)量且處于對數(shù)期生長期時，消化收集細胞，用培養(yǎng)基重新懸浮調(diào)到所需的細胞濃度備用。

1.3人工氣室的建立雞胚購于西安市耿鎮(zhèn)孵化場，用750 mL/L的乙醇消毒后，置于37 ℃恒溫電熱培養(yǎng)箱內(nèi)隔水式孵育，選擇孵育良好的雞胚進行實驗。根據(jù)文獻[6]的方法并適當改進建立人工氣室。在消毒好的超凈臺上通過照卵燈確定胚頭的大致位置，在胚頭右下方約0.5～1.0 cm處標記確定開窗部位，750 mL/L乙醇消毒后，用小鑷子在雞胚氣室端輕戳一小口，然后小心地去掉周圍的蛋殼和殼膜，開口直徑約為2 cm大小，便于后期實驗觀察。此時可以看到氣室底部白色的氣室膜，滴數(shù)滴無菌生理鹽水，使白色氣室膜變成透明色，小心地用注射針頭在氣室膜中央挑一小口，然后用小鑷子輕輕剝除上層的氣室膜，充分暴露下層透明的CAM膜。后將收集好的腫瘤細胞20 μL接種于CAM膜上相對無血管區(qū)。接種后用無菌透明膠帶封閉窗口，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

1.4實驗設計及處理

1.4.1觀察胚齡對雞胚成瘤率及雞胚活力的影響 收集處于生長對數(shù)期的ATC細胞，用培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)為每20 μL含有5×106個的細胞，接種在胚齡分別為9、10、11、12、13的雞胚尿囊膜上，每組10只雞胚，每只雞胚接種20 μL細胞懸液。每天觀察雞胚的存活情況以及存活雞胚成瘤及移植瘤生長情況(以肉眼見移植瘤≥2 mm為成瘤陽性)。

1.4.2觀察腫瘤細胞數(shù)對雞胚成瘤率及雞胚活力的影響 選取發(fā)育良好的12日雞胚，收集處于生長對數(shù)期的ATC FRO細胞，用培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)為每20 μL分別含有2×106、4×106、6×106、8×106、10×106個細胞，每組10只，每只接種20 μL細胞懸液；對照組接種20 μL的無菌生理鹽水。每天觀察雞胚的存活情況以及存活雞胚成瘤及移植瘤生長情況(以肉眼見移植瘤≥2 mm為成瘤陽性)。

1.4.3觀察雞胚移植瘤的原位生長情況 選取發(fā)育良好的12日雞胚10個，收集處于生長對數(shù)期的ATC FRO細胞，用培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)為每20 μL含有6×106個的細胞，將配好的細胞懸液接種在CAM上，每天取出兩只，觀察移植瘤的顏色、大小、性狀及誘導血管生成的情況，Olympus數(shù)碼相機拍照并用直尺測量體積(V=1/2(長徑×短徑2)[7]，繪制生長曲線。

1.4.4觀察移植瘤的組織形態(tài)學 選取生長良好的移植瘤標本，經(jīng)100 mL/L甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋、切片以及HE染色。用光學顯微鏡(BHS205444型)觀察組織形態(tài)并拍照。

1.5統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行單因素分析。各實驗組的存活率與成瘤率選用χ2檢驗(α=0.05)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有圖片采用Image-Pro Plus 6.0處理，移植瘤生長曲線圖形采用OriginPro 8.5繪制。

2結果

2.1胚齡對雞胚成瘤率及雞胚活力的影響接種不同胚齡的CAM與存活雞胚數(shù)和成瘤雞胚數(shù)的關系(表1)。不同胚齡的雞胚存活率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.016)，不同胚齡的雞胚成瘤率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.596)。

2.2腫瘤細胞數(shù)對雞胚成瘤率及雞胚活力的影響接種不同數(shù)量的ATC FRO細胞與存活雞胚數(shù)和成瘤雞胚數(shù)的關系(表2)。接種不同數(shù)量的FRO細胞數(shù)與雞胚存活率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)，接種不同數(shù)量的FRO細胞數(shù)與雞胚成瘤率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005)。

2.3雞胚移植瘤原位生長情況在12日齡CAM上接種20 μL含6×106個細胞數(shù)的ATC FRO細胞，在接種后的第2天及以后每天取2個雞胚觀察雞胚移植瘤生長情況。在透明的CAM上接種20 μL的ATC FRO細胞懸液后，白色的細胞懸液如白色薄膜貼在CAM上，邊界清楚。腫瘤細胞接種第2天，白色細胞懸液向中心匯聚生長，出現(xiàn)微弱的血管反應(圖1A)。第3天，白色腫瘤組織開始向周圍侵入生長，腫瘤組織周圍的毛細血管向腫瘤組織呈放射狀生長，顏色鮮紅，CAM的透明度開始降低(圖1B)。第4天，腫瘤組織的厚度開始增加，周圍的毛細血管開始增粗，顏色深紅，CAM透明度進一步降低(圖1C)。第5天，腫瘤組織向周圍CAM侵入生長加快，且厚度也增加，營養(yǎng)腫瘤組織的血管增粗明顯，顏色暗紅，CAM透明度消失，腫瘤向外侵入生長旺盛(圖1D)。第6天，腫瘤組織向外侵入生長減慢，白色腫瘤組織表面出現(xiàn)壞死，周圍血管變化不明顯(圖1E)。雞胚移植瘤瘤體生長曲線呈“S”型，可以直觀的看到，第1天至第4天，腫瘤瘤體緩慢生長，在第5天，腫瘤生長迅速增加并達到高峰，第6天開始，腫瘤生長開始減慢(圖2)。

表1 不同胚齡對雞胚成瘤率及雞胚活力的影響

表2 不同數(shù)量的ATC細胞對雞胚成瘤率及雞胚活力的影響

圖1 雞胚移植瘤的生長情況

圖2 雞胚移植瘤的生長曲線

2.4移植瘤的組織形態(tài)學觀察肉眼觀ATC雞胚移植瘤組織為乳白色，形態(tài)不規(guī)則，邊界清楚，有些因缺血表面出現(xiàn)壞死，質(zhì)軟易碎，切面為淡黃色(圖1F)。光鏡下見雞胚移植瘤瘤細胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，細胞核大且深染，形態(tài)多樣，有核分裂相，細胞質(zhì)少(圖3A)，其與人ATC組織結構(圖3F)相似。腫瘤細胞侵入正常組織中，其中紅色箭頭區(qū)為腫瘤細胞區(qū)，細胞核大且深染，黑色箭頭區(qū)為正常的雞胚絨膜尿囊膜纖維組織，細胞呈條索狀，排列整齊，胞核小，胞質(zhì)多，黃色箭頭所指區(qū)為淋巴細胞，細胞核小且染色深，整個區(qū)域為炎癥反應區(qū)(圖3B)。在炎癥反應區(qū)的淋巴細胞中可見侵入的瘤細胞(圖3C)；在正常組織中可見營養(yǎng)腫瘤的管道(圖3D)；在正常組織中可見瘤栓(圖3E)。

圖3 雞胚移植瘤的HE染色

3討論

用人ATC細胞株FRO建立雞胚移植瘤模型，國內(nèi)外尚未見報道。本實驗首次將FRO細胞接種在CAM上，腫瘤組織在CAM存活生長，并且呈現(xiàn)向周圍組織侵入生長的趨勢，HE染色顯示腫瘤形態(tài)與人甲狀腺未分化癌組織形態(tài)相似，證明了建立甲狀腺未分化癌雞胚移植瘤模型的成功。

CAM即雞胚尿囊發(fā)育過程中的尿囊體壁中胚層與絨毛膜臟壁中胚層融合形成的一層透明薄膜。CAM含有豐富的毛細血管叢，并且與周圍多孔的外殼緊貼，有利于氣體與營養(yǎng)物質(zhì)交換。這些特點使CAM成為雞胚的重要呼吸器官，也使它能有效地支持移植瘤組織的生長；同時，它又是天然的膜性屏障，可以模擬腫瘤在侵襲過程中的基底膜作用[8]。雞胚具有簡便、快捷、經(jīng)濟、實驗周期短、操作簡單、培養(yǎng)方便、不需要特殊設備等優(yōu)點[9]。因此，雞胚廣泛用于新生血管生成、微循環(huán)、腫瘤生物等方面的研究[10]，尤其用于抗腫瘤的侵襲生長[11]。孫輝等[12]利用裸鼠甲狀腺原位TA-K細胞微量注射法，成功建立人甲狀腺未分化癌裸鼠原位移植模型。雖然裸鼠模型能夠很好地模擬人甲狀腺未分化癌的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移，但裸鼠的飼養(yǎng)條件要求高，實驗周期長，價格比較昂貴，大多實驗室受到限制，而發(fā)育初期的雞胚，免疫系統(tǒng)不健全排異反應小，類似免疫缺陷的裸鼠。

在預實驗中，我們借鑒張斌等[6]在CAM上接種腫瘤細胞的方法并適當改變，在剝離氣室膜時，我們首先在白色氣室膜上滴數(shù)滴無菌生理鹽水，使白色氣室膜變成透明色，小心地用注射針頭在氣室膜中央挑一小口，然后用小鑷子輕輕剝除上層的氣室膜，此操作減少對CAM膜的損傷，大大降低操作難度，使雞胚存活率接近100%。因此，我們只在接種細胞濃度與胚齡方面作進一步研究，并觀察腫瘤的生物學特征及形態(tài)學特征。

首先，我們選取9～13日齡的雞胚分組研究，結果顯示，不同胚齡與雞胚存活率差異有統(tǒng)計學意義，11日齡與12日齡的明顯高于其他日齡，9日齡與10日齡可能胚齡過小、抗環(huán)境變化的能力弱，容易死亡。13日齡的雞胚由于免疫系統(tǒng)已初步發(fā)育，對于異種移植物可能有排斥作用，也易于死亡。在免疫系統(tǒng)未發(fā)育之前，腫瘤細胞在CAM上生長情況不同。所以，我們選擇存活率與成瘤率都較高的12日雞胚做進一步研究。

其次，細胞種類不同，接種的細胞數(shù)也有差別。大多文獻上選用的細胞數(shù)達到106個。因此，我們將細胞懸液分別配成每20 μL分別含有2×106、4×106、6×106、8×106、10×106個的細胞。結果顯示，不同細胞數(shù)與雞胚存活率差異有統(tǒng)計學意義。在一定的細胞數(shù)范圍內(nèi)，腫瘤細胞數(shù)越多，成瘤率越高，但超出一定的范圍，成瘤率反而降低，說明在雞胚承受的范圍內(nèi)細胞數(shù)多，成瘤的機會越大，但是當細胞數(shù)超越雞胚承受能力時，腫瘤細胞數(shù)量越多，越容易導致雞胚死亡。因此，從結果中我們選擇存活率與成瘤率都相對高的6×106細胞數(shù)作進一步研究。

最后，我們觀察接種后移植瘤的生長情況。從圖片與數(shù)據(jù)的分析中，我們發(fā)現(xiàn)在接種后第5天，腫瘤生長達到旺盛狀態(tài)，且周圍血管也增粗增多，如果對腫瘤組織進行藥物等其他方面的處理，選擇第5天效果會更好。此外，我們將CAM移植瘤組織的HE染色切片與人ATC組織的HE染色切片進行比較，發(fā)現(xiàn)它們的組織形態(tài)相似，且充分保持未分化狀態(tài)，這說明了ATC CAM移植瘤可模擬ATC在人體內(nèi)的生長模式。

甲狀腺未分化癌雞胚尿囊膜移植瘤模型的成功建立為以后甲狀腺未分化癌的研究提供了一個方便、簡單、可視的模型。該模型可用于甲狀腺未分化癌生長特性、血管生成機制、篩選腫瘤化療藥物、腫瘤對放療敏感性及基因片段治療腫瘤等方面的研究。但是，由于雞胚是未成熟動物，各個組織器官未發(fā)育完善，所以我們在以后的研究中應該充分考慮這一客觀因素的影響。

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