KCa3.1通道抑制劑TRAM-34對TGF-β1誘導系膜細胞增生的影響

付榮國，陳 釗，張 濤，馬立群，杜 燕，吳喜利，田李芳，侯靜靜，劉曉丹，安 鵬，姚綱練

(1.西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院腎病內科，陜西西安 710004；2.西安交通大學醫(yī)學院，陜西西安 710061；3.西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，陜西西安 710004；4.西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院干部病房，陜西西安 710004)

慢性腎臟疾病每年以10%的速度在進展。美國腎臟病患者總數已經超過2 000萬，醫(yī)院每年收治腎臟病患者高達100多萬。我國目前尚無具體的慢性腎臟病流行病學調查數據，但初步結果顯示，40歲以上人群慢性腎臟病的患病率為10%左右。這給社會和家庭造成巨大的的經濟負擔，迫切需要尋找能夠防治慢性腎臟疾病進展的方法或技術。中電導鈣激活鉀離子通道KCa3.1(intermediate conductance Ca2+-activated K+-channel，IK/KCa3.1/KCNN4)是1997年ISHII等[1]從人胰腺組織中克隆出的一種鉀離子通道，屬于中電導鈣激活鉀離子通道和KCNN4基因家族。目前研究發(fā)現，其在紅細胞[2-3]、T淋巴細胞[4]、肺臟上皮細胞[5]和樹突狀細胞[6]、血管內皮細胞[7]、腎小管上皮細胞、系膜細胞和成纖維細胞等均有表達[8-10]。抑制KCa3.1通道，可以減少角膜纖維化[10]、抑制腫瘤細胞[11]和血管平滑肌細胞增殖[12]。KCa3.1參與腎囊腫的形成[13]，在單側輸尿管結扎(UUO)大鼠中可以加重腎間質纖維化的發(fā)展，敲除或抑制KCa3.1通道可以減少腎臟成纖維細胞增殖，從而減少腎間質纖維化的發(fā)生[14]。本實驗首次研究KCa3.1通道特異性阻滯劑TRAM-34對TGF-β1誘導的大鼠系膜細胞增生的抑制作用，間接證明KCa3.1可能參與了TGF-β1誘導的腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展過程。

1材料與方法

1.1材料與試劑系膜細胞株(HBZY-1，中國科學院上海生科院細胞資源中心)；DMEM(Gibco)；MTT(Amresco)；DMSO(美國Sigma)；Recombinant Human TGF-β1(Lot#0506S354，上海希美生物科技有限公司)；TRAM-34(Biomol，product No.BML-KC161-0005)；6孔板和96孔板(Nunc)；酶標儀(BIO-RAD 680，美國伯樂)；碘化丙啶(PI，藍博斯特生物技術有限公司)；RNase(北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司)；BD FACSCantoⅡ(美國)；RT-PCR擴增反應試劑盒(天根生化科技有限公司)。

1.2細胞培養(yǎng)及分組HBZY-1細胞在含有200 mL/L胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，取對數生長期的細胞，按1×106個/mL接種于培養(yǎng)皿內，置于37 ℃、50 mL/L CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分組。TGF-β1的濃度根據預實驗和文獻資料確定為2 ng/mL。配制2 ng/mL TGF-β1儲備液，加入抑制劑TRAM-34，使在含有2 ng/mL刺激因子TGF-β1的條件下，TRAM-34的終濃度分別為0、8、16、24 nmol/L。細胞給藥分組，即Control組(空白對照組)、TGF-β1+TRAM-34組(共4組，各組TRAM-34濃度分別為0、8、16、24 nmol/L)。各組細胞給藥培養(yǎng)24 h后分別進行流式細胞儀檢測和MTT實驗。

1.3流式細胞儀檢測細胞周期的變化細胞按1.2分組給藥培養(yǎng)24 h后，2.5 g/L胰酶消化細胞，收集細胞懸液，1 000 r/min離心7 min，用PBS清洗1遍，棄上清。加入700 mL/L乙醇1 mL固定細胞，輕輕混勻，4 ℃放置1～2 h。細胞懸液1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入RNase 100 μL，37 ℃孵育30 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清后避光加入PI 400 μL。以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數2～3萬個細胞，結果用細胞周期擬合軟件Modfit分析。

1.4MTT法檢測TRAM-34對細胞增殖的抑制作用細胞按1.2分組給藥，每孔加入200 μL，培養(yǎng)24 h后，吸棄舊培養(yǎng)液，每孔加入180 μL無血清培養(yǎng)液和MTT溶液20 μL(MTT終質量濃度為0.5 mg/mL)，37 ℃繼續(xù)孵育24 h，終止培養(yǎng)。吸棄孔內上清液每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490 nm波長測定各孔的吸光度A值，計算平均抑制率，公式為：平均抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值。

1.5RT-PCR技術檢測TRAM-34對系膜細胞α-SMA和FSP-1表達的影響將HBZY-1細胞傳代并計數接種到細胞培養(yǎng)皿中，貼壁后，根據1.3和1.4實驗結果確定TRAM-34最佳抑制濃度，分別作用0、15、30、60 min，采用RT-PCR分別檢測系膜細胞α-SMA和FSP-1轉錄水平表達變化。用Trizol試劑提取各處理條件下的細胞總RNA，使用之前用紫外/可見分光光度計測定RNA的純度和含量。cDNA合成過程按照TaKaRa公司反轉錄試劑盒(PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)說明書步驟進行。RT-PCR擴增反應使用天根生化科技有限公司的RealMasterMix (SYBR Green)試劑盒進行定量，TaKaRa公司的RT-PCR儀進行實時檢測，所有步驟均在冰上進行。PCR的反應條件為：初始變性(95 ℃，3 min)；40個循環(huán)的變性(95 ℃，5 s)；退火(58.5 ℃，10 s)；延伸(72 ℃，20 s)；最后延伸(72 ℃，10 min)。α-SMA和FSP-1的序列見表1。

表1 α-SMA和FSP-1的mRNA序列及產物長度

2結果

2.1TRAM-34對細胞周期的影響TGF-β1組(TRAM-34 0 nmol/L)經2 ng/mL TGF-β1刺激系膜細胞24 h，與空白對照組比較，細胞周期G0～G1期細胞百分比明顯增高[(48.45±1.89)%、(70.29±1.84)%，P<0.01]，而S期細胞百分比相應下降[(38.54±1.13)% 、(19.56±1.67)%，P<0.01]；TGF-β1+TRAM-34(8、16、24 nmol/L)組系膜細胞G0～G1期百分比明顯減少，S期百分比明顯增多。與TGF-β1組比較，24 nmol/L TRAM-34組變化最明顯[G0～G1期：(70.29±1.84)%、(61.90±1.88)%；S期：(19.56±1.67)% 、(25.52±1.62)%]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2TRAM-34對細胞增殖的影響各濃度TRAM-34對TGF-β1誘導系膜細胞增生均有抑制作用，其中24 nmol/L組抑制作用最顯著，與8 nmol/L和16 nmol/L組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖1)。

圖1 不同濃度TRAM-34對系膜細胞增殖的影響

2.3TRAM-34對α-SMA和FSP-1表達的影響TRAM-34刺激系膜細胞30 min和60 min，與對照組(0 min)和15 min組相比，α-SMA的mRNA的表達水平明顯下降；FSP-1的mRNA表達水平在TRAM-34刺激系膜細胞60 min顯著下降(圖2)。

圖2 TRAM-34對系膜細胞α-SMA(A)和FSP-1(B)表達的影響

3討論

最近研究發(fā)現，中電導鈣激活鉀離子通道KCa3.1參與腫瘤細胞收縮遷移和血管平滑肌細胞、腎臟成纖維細胞、肺臟上皮細胞的增生過程，抑制KCa3.1可以抑制腫瘤轉移、血管硬化和心肌、肺臟、腎臟的纖維化[5,10-12,14-15]。系膜細胞上也有中電導鈣激活鉀離子通道[9]。本研究首次發(fā)現，KCa3.1通道特異性抑制劑TRAM-34可以明顯改善系膜細胞周期，使阻滯于G0～G1期的細胞減少，S期細胞的比例增加，間接提示KCa3.1通道參與了TGF-β1誘導的系膜細胞增生。

TRAM-34是中電導鈣激活鉀離子通道KCa3.1的特異性抑制劑，是一種高度親脂性、膜通透的三芳香基甲烷TRAM的類似物。TRAM在KCa3.1通道上的結合位點分別為pore region第250位的蘇氨酸(簡稱Thr250)和S6跨膜域第275位的纈氨酸(簡稱Val275)。文獻報道，TRAM-34在作用后90 min以內就可被胞質膜完全內吞，然后與位于細胞內膜的KCa3.1通道上的Thr250和Val275結合，Thr250和Val275在疏水孔道內沿K+選擇“濾過器”“GYG”線性排列，Thr250和Val275側鏈上的甲基能與TRAM苯環(huán)周圍的π-電子云通過疏水鍵緊密結合，從而鎖住TRAM[16]。于是，TRAM芳香環(huán)的一半遮蓋住了“GYG”，由此阻擋了K+內流的途徑[17]。而K+內流的減弱鉗制膜電位的去極化，使Ca2+的內流隨之減弱，并導致相應的細胞活動受到抑制。本實驗采用不同濃度TRAM-34作用于TGF-β1誘導增生的系膜細胞，發(fā)現TRAM-34的3個濃度組中阻滯于G0～G1期的系膜細胞周期有明顯改善，表現為G0～G1期細胞百分比下降，S期細胞百分比增加，與對照組和TGF-β1組相比，差異有統(tǒng)計學意義，提示TRAM-34對TGF-β1誘導的系膜細胞增生具有抑制作用。細胞增生時細胞體積增大，表型轉分化，許多細胞出現早衰并由此進入早期凋亡。TRAM-34改善細胞周期，使阻滯于G0～G1期的增生和轉分化的系膜細胞進入S期，有助于改善細胞的增生與表型轉分化，減少早衰。在MTT實驗中也可以得到類似的結果，不同濃度的TRAM-34對細胞增生具有抑制作用，其中24 nmol/L的TRAM-34抑制作用最大。

系膜細胞是腎臟中數量最多的固有細胞之一，具有吞噬、分泌、收縮和遷移等重要特性。在IgA腎病、狼瘡性腎炎、局灶階段性腎小球硬化、膜增生性腎小球腎炎等腎臟疾病的進展中，產生一系列以系膜病變?yōu)橹饕±碜兓哪I小球疾病。任何一種腎小球疾病在不同時期內都可見腎小球系膜病變[18]。α-SMA和FSP-1是細胞表型轉分化的標志性抗原[19]。FSP-1是一種鈣結合蛋白，又稱S100A4，它是S100基因家族成員，也是細胞骨架蛋白之一，與微管動力學、細胞支架、信號傳遞、細胞周期調節(jié)、細胞生長和分化緊密相關。在正常系膜細胞、小管細胞和內皮細胞均不能檢測到FSP-1，而在成纖維細胞和纖維化的腎臟能檢測到其強烈表達[20]。本實驗采用24 nmol/L的TRAM-34可以抑制KCa3.1通道的表達，降低α-SMA和FSP-1表達，并呈時間依賴性。提示TRAM-34可以通過抑制KCa3.1通道，改善細胞表型轉分化、減少腎臟系膜細胞早衰的作用。進一步觀察TRAM-34對細胞膠原產生及相關信號通路的影響，將對腎小球硬化的防治提供有益幫助。

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