CTLA4.FasL免疫抑制效應(yīng)及對肝前體細胞增殖分化潛能的影響

萬 真，呂 毅，張曉剛

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，先進外科技術(shù)與工程研究所，陜西西安 710061)

成體肝臟來源的肝前體細胞具有細胞體積小、增殖能力較強及可生成肝細胞和膽管上皮細胞等特點，可用于體內(nèi)移植治療終末期肝病[1]。移植的肝前體細胞可在受體內(nèi)存活、定植，有效增殖并進一步分化為有功能活性的肝細胞[2]。不過，肝前體細胞表達主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子(major histocompatibility complex-I, MHC-Ⅰ)，仍有較強的免疫原性，可誘發(fā)受體免疫排斥反應(yīng)[3]。本實驗構(gòu)建了攜帶免疫調(diào)控基因CTLA4.FasL的慢病毒載體，評估CTLA4.FasL對肝前體細胞增殖活性及分化潛能的影響，并進一步研究負載CTLA4.FasL基因的小鼠肝前體細胞在單向混合淋巴細胞反應(yīng)中抑制異種淋巴細胞增殖的作用。這可能為肝前體細胞移植的免疫排斥這一難題提供有效的解決途徑。

1材料與方法

1.1實驗用細胞、藥品和主要試劑細胞系肝上皮樣前體細胞(liver epithelial progenitor cells, LEPCs)由上海第二軍醫(yī)大學細胞生物學系胡以平教授提供[4]，質(zhì)粒GV261、pHelper 1.0和pHelper 2.0和293T細胞購自上海吉凱基因化學有限公司，攜帶CTLA4.FasL基因的pcDNA3.1(-)由本室凍存。Taqpolymerase、PrimeScript?RT Master Mix Perfect Real Time和SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa公司)；DMEM、RMPI 1640及胎牛血清(Hyclone公司)；Trizol試劑和Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；兔抗人FasL(Santa Cruz公司)；Cell proliferation Reagent(WST-1)和Cell proliferation ELISA、Brdu(colorimetric)均為Roche公司；sFasL ELISA試劑盒(Raybiotech公司)；淋巴細胞分離試劑(天津灝洋公司)；臺盼藍、絲裂霉素C(mitomycinC, MMC)購自Sigma公司。

1.2實驗動物SD大鼠，體質(zhì)量200～300 g；C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～25 g，均由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。飼養(yǎng)于SPF級實驗室，自由進食飼料及水，實驗操作經(jīng)西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.3CTLA4.FasL的獲取以攜帶CTLA4.FasL基因的質(zhì)粒pcDNA3.1(-)為模板，擴增目的基因。設(shè)計、合成引物如下：CGGGTACCGGTCGCCACCATGGGTGTACTGCTCACAC和AGTCGCTAGCTT-AGAGCTTATATAAGCCGAAAAAC，下劃線標記的分別是AgeⅠ和NheⅠ酶切位點。PCR反應(yīng)條件是94 ℃變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)后，72 ℃延長10 min。將PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，預(yù)期可見961 bp大小的條帶。切膠純化后送TaKaRa公司測序，以排除堿基錯配等變異的發(fā)生。

1.4攜帶CTLA4.FasL基因的慢病毒載體的制備將獲得的目的基因片段CTLA4.FasL經(jīng)AgeⅠ和NheⅠ雙酶切后定向連接入線性化載體Lv-IRES-mCherry。取慢病毒包裝的輔助質(zhì)粒pHelper 1.0和pHelper 2.0，兩者含有pol、VSG-G等基因以編碼病毒特異性的酶和包膜蛋白，與重組病毒質(zhì)粒使用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染入293T細胞，轉(zhuǎn)染8 h后更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，純化濃縮，-80 ℃長期保存。可得到攜帶目的基因的重組慢病毒載體Lv-CTLA4.FasL-IRES-mCherry，不攜帶目的基因的慢病毒空載體Lv-IRES-mCherry作為陰性對照組。針對慢病毒特異性WRPE元件設(shè)計引物(表1)，利用RT-PCR法測定慢病毒滴度。

表1 RT-PCR引物序列

F：上游引物；R：下游引物。

1.5重組慢病毒載體體外感染LEPCsLEPCs細胞接種于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、50 mL/L CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d換液一次，3～4 d傳代一次。接種生長良好的LEPCs細胞于6孔細胞培養(yǎng)板中，待完全貼壁后，換用含重組慢病毒顆粒的細胞培養(yǎng)液。調(diào)整慢病毒載體的用量，分別以MOI為1、5、10、20、100感染LEPCs細胞。在培養(yǎng)體系中，添加聚凝胺以增加感染效率。慢病毒感染5 d后，在熒光顯微鏡下觀察比較各組細胞的活力和紅色熒光蛋白mCherry的表達。倒置熒光顯微鏡200倍視野下計數(shù)被感染細胞及總細胞，隨機選擇5個視野。感染效率=(感染成功的細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。提取經(jīng)慢病毒感染的LEPCs細胞的總蛋白行FasL蛋白印跡分析。

1.6ELISA法檢測培養(yǎng)上清中融合蛋白CTLA4.FasL的濃度收集慢病毒感染后的細胞培養(yǎng)液，4 ℃ 400×g離心6 min去除細胞碎片，取上清經(jīng)0.2 μm的無菌注射過濾器過濾，-20 ℃凍存。按照ELISA試劑盒說明進行操作，使用Bio-Tek Elx 800酶標儀檢測，記錄450 nm處的吸光度值。

1.7WST-1法檢測細胞增殖活性未感染慢病毒的LEPCs細胞為LEPCs組；感染含CTLA4.FasL基因的慢病毒細胞為CTLA4.FasL-LEPC組；感染含mCherry基因的慢病毒細胞為mCherry-LEPCs組。3組細胞均以5×103細胞數(shù)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入含 100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液100 μL。培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL WST-1，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，振蕩1 min以充分溶解結(jié)晶物，在酶標儀上讀取450 nm波長處和690 nm波長處各孔吸光度值，計算兩者之間的差值(A450 nm-A690 nm)。每組設(shè)3個平行樣本，取各組值的均數(shù)表示細胞的增殖情況。

1.8RT-PCR法檢測CK-19和c-Kit基因表達的變化收集3組細胞，用Trizol提取細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃凍存。根據(jù)NCBI GenBank中提供的小鼠CK19和c-Kit基因序列設(shè)計引物，以β-actin為內(nèi)參基因(表1)。使用TaKaRa SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑盒，在Bio-Rad iQ5多色實時定量PCR檢測系統(tǒng)中按三步法進行擴增。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗結(jié)果重復(fù)3次。

1.9單向混合淋巴細胞反應(yīng)無菌條件下切取大鼠和小鼠脾臟，用組織淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。收集淋巴細胞，用含100 mL/L胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液重懸細胞并調(diào)整細胞濃度1×106/mL，臺盼藍染色檢測淋巴細胞活性。以小鼠淋巴細胞為刺激細胞，大鼠淋巴細胞為反應(yīng)細胞。給予刺激細胞25 μg/mL的MMC處理，37 ℃孵育30 min以抑制小鼠淋巴細胞的增殖能力。接種刺激細胞和反應(yīng)細胞各100 μL于96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、50 mL/L CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.10Brdu法測定大鼠淋巴細胞的增殖在Brdu法中，利用5-氟脫氧尿嘧啶(5-bromo-deoxyuridine, Brdu)代替3H胸腺嘧啶標記合成的DNA，基于抗原Brdu的ELISA檢測可靈敏、簡便及安全地測定細胞合成DNA的能力，間接反映細胞的增殖情況。淋巴細胞共培養(yǎng)4 d后，每孔加入Brdu標記液孵育6 h，后經(jīng)固定液、抗Brdu抗體工作液處理，加入反應(yīng)底物，在370 nm和492 nm處測定吸光度值，以空白組調(diào)零，計算兩者之間的差值。取LEPCs、mCherry-LEPCs和CTLA4.FasL-LEPCs細胞經(jīng)50 μg/mL的MMC 37 ℃孵育1 h。PBS洗2次后以1×104細胞數(shù)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，待完全貼壁后再接種大鼠淋巴細胞和MMC處理的小鼠淋巴細胞，測定大鼠淋巴細胞的增殖情況。以大鼠淋巴細胞單獨培養(yǎng)為陰性對照，測定各組大鼠淋巴細胞的增殖情況，以刺激指數(shù)(stimulation index, SI)表示：SI=A492 nm-A370 nm(實驗組)/A492 nm-A370 nm(陰性對照組)。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗結(jié)果重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1CTLA4.FasL基因的PCR擴增PCR產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見961 bp大小的條帶(圖1)。測序結(jié)果與GenBank中人CTLA4(序列接收號：BC074893)和FasL(序列接收號：BC017502)相比，堿基序列完全正確。

2.2構(gòu)建攜帶CTLA4.FasL的重組慢病毒載體同源重組法得到復(fù)制缺陷性慢病毒載體Lv-CTLA4.FasL-IRES-mCherry和空白慢病毒載體Lv-IRES-mCherry。純化、濃縮慢病毒液，RT-PCR測得其滴度為2×108TU/mL。

2.3Lv-CTLA4.FasL-IRES-mCherry感染LEPCs在MOI為1、5和10時，表達紅色熒光細胞占總細胞比例逐漸增高，熒光強度逐漸增強，細胞形態(tài)無明顯變化。不過，繼續(xù)增加慢病毒用量，MOI增大為20和100時，大量LEPCs死亡，細胞增殖停止，提示高慢病毒用量或是目的蛋白的高表達對細胞有強烈的毒性作用。在感染體系中添加5 μg/mL聚凝胺，MOI為10時，感染效率可高達90%(圖2)。因此，在此后的實驗中，均采用這一條件下慢病毒感染的LEPCs細胞。Western blot檢測顯示，CTLA4.FasL蛋白可在CTLA4.FasL-LEPCs細胞中有效表達，而在LEPCs和mCherry-LEPCs內(nèi)無表達(圖3)。

圖1 CTLA4.FasL基因的PCR擴增

圖2 紅色熒光蛋白在LEPCs內(nèi)的表達

圖3 Western blot 檢測重組慢病毒載體感染LEPCs后CTLA4.FasL的表達

2.4LEPCs細胞培養(yǎng)上清液CTLA4.FasL濃度的測定慢病毒Lv-CTLA4.FasL-IRES-mCherry感染LEPCs細胞培養(yǎng)上清液中CTLA4.FasL質(zhì)量濃度可達(0.72±0.10)μg/mL，可在-20 ℃長期凍存。mCherry-LEPCs和LEPCs細胞培養(yǎng)上清液不能檢測到CLTA4.FasL的表達。

2.5重組慢病毒感染后LEPCs增殖活性及分化潛能的改變WST-1實驗結(jié)果顯示，CTLA4.FasL-LEPCs 的A450 nm-A690 nm值為1.361±0.073，而mCherry-LEPCs和LEPCs則分別為1.369±0.078、1.383±0.117。單因素方差分析示3組LEPCs細胞增殖活性無統(tǒng)計學差異(F=0.517，P=0.603)。這表明MOI=10時，慢病毒感染及CLTA4.FasL的表達對LEPCs的增殖能力無明顯損害作用。以β-actin基因mRNA表達水平為參照，利用2-△t法計算CK19和c-Kit基因的相對表達量(表2)。CK19和c-Kit mRNA的表達在慢病毒Lv-CTLA4.FasL-IRES-mCherry和Lv-IRES-mCherry感染前后均無明顯變化(F=2.472，P=0.165；F=0.305，P=0.748)。

表2 RT-PCR檢測3組LEPCs細胞CK19和c-Kit mRNA的表達

2.6CTLA4.FasL對大鼠淋巴細胞增殖的影響小鼠淋巴細胞與大鼠淋巴細胞共培養(yǎng)96 h后，大鼠淋巴細胞顯著增殖，刺激指數(shù)為6.444±0.424。在異種淋巴細胞共培養(yǎng)(mixed lymphocyte culture, MLC)體系中接種CTLA4.FasL-LEPCs細胞，大鼠淋巴細胞增殖受抑制，刺激指數(shù)減少至2.337±0.266(P<0.05)。而LEPCs和mCherry-LEPCs細胞無此免疫抑制效應(yīng)(圖4)。

圖4 3組LEPCs細胞對大鼠淋巴細胞增殖的影響

3討論

隨著干細胞生物學表型的鑒定及分離純化技術(shù)的進步，肝前體細胞移植用于終末期肝病的治療顯示了愈發(fā)誘人的前景。本實驗中用到的肝前體細胞系由接受倒千里光堿腹腔注射聯(lián)合2/3肝切除的小鼠肝臟分離、純化而來。這類上皮樣非實質(zhì)細胞在門管區(qū)活化、增殖，形成管狀結(jié)構(gòu)并向肝小葉中延伸，可進一步生成嗜堿性肝細胞團和膽管結(jié)構(gòu)。體外培養(yǎng)條件下表達CK19、Thy-1、c-Kit等干細胞相關(guān)基因，可誘導生成肝細胞和膽管上皮細胞。因此，被命名為肝上皮樣前體細胞(liver epithelial progenitor cells, LEPCs)。較原代肝細胞體外培養(yǎng)多需要3D培養(yǎng)技術(shù)及添加特殊的生長因子，培養(yǎng)數(shù)周內(nèi)其表型、功能逐步喪失，LEPCs可在單層貼壁培養(yǎng)條件下大量擴增，同時保留雙向分化潛能。另外，LEPCs多次傳代后仍保持正常核型38+XY，種植入裸鼠皮下未見腫瘤形成，提示在無致癌因素存在的情況下LEPCs不會惡性轉(zhuǎn)化為腫瘤起始細胞[5]。LEPCs是肝干細胞生物學特性及移植研究的有力工具。

為支持肝功能，促進肝損傷的修復(fù)，需要有足夠數(shù)量的肝前體細胞在受體內(nèi)長期有效地植入，并分化為有代謝、合成等功能的肝細胞[6]。不過，植入分化過程及新生成的肝細胞必將誘發(fā)強烈的免疫排斥反應(yīng)，導致移植物功能受損甚至移植物丟失[7]。細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原(cytotoxic T lymphocyte associate antigen-4, CTLA4)是T細胞下調(diào)分子，在建立外周免疫耐受中發(fā)揮著重要作用。LAN等[8]發(fā)現(xiàn)，較陰性對照組，在移植18周內(nèi)CTLA4.Ig基因修飾的人源肝前體細胞能在受體小鼠肝臟內(nèi)顯著存活、增殖。活化T細胞上調(diào)表達Fas受體，與FasL結(jié)合后可啟動凋亡途徑以限制免疫應(yīng)答。而CTLA4.FasL分子含有CTLA4和FasL雙功能域，能在抑制初始T細胞的活化增殖的同時誘導活化的T細胞凋亡，其效應(yīng)遠遠高于單個免疫分子或兩者聯(lián)合應(yīng)用[9-11]。本實驗中Lv-CTLA4.FasL-IRES-mCherry感染的LEPCs細胞能強有力地抑制單向混合淋巴細胞共培養(yǎng)中大鼠淋巴細胞的增殖，表明在異種淋巴細胞的活化增殖中CTLA4.FasL同樣具有負性調(diào)控作用。而LEPCs細胞無此抑制效應(yīng)，提示不同于間充質(zhì)干細胞[12]，LEPCs本身不能表達免疫調(diào)節(jié)分子從而抑制淋巴細胞的活化增殖。

FasL分子與其細胞膜表面受體Fas結(jié)合后能啟動細胞凋亡途徑，有著潛在的細胞毒性[13-14]。不過，CTLA.FasL分子將FasL胞外區(qū)代之以CTLA4胞外區(qū)，通過與B7分子的高效結(jié)合增加其對活化T淋巴細胞的靶向性，這能極大地減輕其細胞毒性作用[15]。在本實驗中，我們評估了Lv-CTLA4.FasL-IRES-mCherry感染對LEPCs的增殖活性及分化潛能的影響。重組慢病毒載體可有效地感染LEPCs(感染率>90%)，CTLA4.FasL蛋白可有效表達。WST-1和RT-PCR實驗結(jié)果示，在慢病毒載體感染前后LEPCs增殖活性和干細胞相關(guān)基因CK19和c-Kit的表達量無明顯變化。

總之，本研究成功構(gòu)建了攜帶CTLA4.FasL基因的慢病毒載體，研究了CLTA4.FasL對LEPCs細胞的增殖活性及分化潛能的影響，探索了負載CLTA4.FasL基因的LEPCs在異種混合淋巴細胞反應(yīng)中抑制大鼠淋巴細胞增殖的作用，為進一步的肝前體細胞移植動物實驗奠定了基礎(chǔ)。

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