慢性牙周炎患者血清miRNA-146a 的表達及其靶基因預測分析

陳 琳

慢性牙周炎(chronic periodontitis， CP ) 是發(fā)生在牙周支持組織的一種慢性感染性疾病， 主要是通過致病微生物及其毒素的刺激引發(fā)的宿主免疫失調，釋放炎癥介質，造成局部組織損傷，其發(fā)病機制的研究不完全清楚，目前尚無十分有效的治療方法。

miRNA-146a 是一種與炎癥密切相關的miRNA，已被證明在免疫、腫瘤、炎癥等方面發(fā)揮著重要的作用[1]。在CP 中，miRNA-146a 的研究情況如何，目前尚未見報道。本文通過檢測miRNA-146a 在CP 患者血清中的表達變化，并對其進行靶基因預測分析， 旨在探討miRNA-146a 在CP 發(fā)生發(fā)展過程中的作用及意義。

1. 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2012 年12 月至2013 年12 月在廈門第174 醫(yī)院口腔科就診的患者，參照《牙周病學》[2]診斷標準診斷為CP 患者為研究對象。收集其血清標本共計27 例， 其中輕度CP 10 例，中度CP 9 例， 重度CP 8 例；男性15 例，女性12例；年齡38-72 歲，平均60.26 歲。另選全口牙周探診深度≤3 mm， 無附著喪失， 出血指數(shù)≥3 的位點數(shù)不超過10%的健康者12 例正常血清作為健康對照組，其中男性6 例，女性6 例；平均60.58歲。所有研究對象均無全身性疾病， 女性未妊娠，就診前6 個月內未進行過牙周治療， 3 個月內未服用過抗生素及免疫抑制劑等， 無吸煙史。所有病例采集均遵循知情同意原則。所有血清標本-80℃保存。

1.2 主要試劑和儀器 miRcute miRNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。實時定量PCR 儀7500(ABI，美國)，超微量紫外分光光度儀PUEX UV(北京博凱思維)。

1.3 方法

1.3.1 QRT-PCR 檢測miRNA-146a 的表達 按miRcute miRNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒說明書操作。以U6為內參，引物序列及PCR 產(chǎn)物片斷大小為：U6上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游：AACGCTTCACGAATTTGCGT，擴增產(chǎn)物為94bp；miRNA-146a 上 游 GCTGAGAACTGAATTCCATGGGT ，下游引物為試劑盒提供的通用引物，擴增產(chǎn)物為76bp；引物由上海生工生物工程公司合成。實驗數(shù)據(jù)采用2-△△CT 法進行分析。

1.3.2 生物信息學預測miRNA-146a 靶基因 采用miRDB(http:/ / miRNAdb.org/ miRDB)、

targetScan(http:/ / www.targetscan.org)、 mi-Randa (http:/ / mic-rorna.org)、 PicTar (http:/ / picTar.mdc-berlin.de)4 個軟件在線預測miRNA-146a 靶基因。

1.4 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)用±s表示，采用SPSS17.0 進行單因素ANOVA 和t 檢驗， 采用GraphPad Prism5.0 進行圖表制作，檢驗水準

α=0.05。

2. 結果

2.1 CP 患者血清miRNA-146a 的表達情況QRT-PCR 結果顯示CP 組miRNA-146a 明顯高于健康對照組，2-△△CT 值分別為分別為4.6567±4.3296、0.7748±0.7840，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見附圖。

附圖 兩組血清標本miRNA-146a 表達比較

2.2 miRNA-146a 的表達與CP 臨床病理參數(shù)間的關系 miRNA-146a 的表達與臨床分期有關，隨著疾病的加重而增高(P＜0.05)，與性別、年齡沒有明顯關系(P＞0.05)，見附表。

附表 miRNA-146a 的表達與臨床病理參數(shù)間的關系(±s)

附表 miRNA-146a 的表達與臨床病理參數(shù)間的關系(±s)

*表示P＜0.05

臨床病理參數(shù) 例數(shù) miRNA-146a 的表達(images/BZ_69_1723_2413_1737_2447.png±s)P 值性別男15 4.7201±4.5243 0.934女12 4.5775±4.2740年齡(歲)≥50 17 4.4344±4.3232 0.735＜50 10 5.0347±4.5471臨床分期輕度 10 1.8960±0.8558 0.007*中度 9 4.7434±4.4456重度 8 8.0100±4.7276

2.3 生物信息學分析結果 TargetScan 預測miRNA-146a 靶基因為200 個，PicTar 預測為130 個，miRanda 預測為6798 個，miRDB 預測為252 個。分析結果顯示miRNA-146a 調節(jié)的靶基因涉及細胞信號轉導、細胞增殖、細胞分化等各個方面。與牙周炎相關的基因有6 個：TLR4、CTSC、MPO、COL1A1、HSPG2、HLA-C。

3. 討論

miRNA 作為天然的基因調控因子， 在轉錄后的水平調控靶基因的表達，它參與免疫細胞發(fā)育、免疫調節(jié)、炎癥以及骨破壞等生理病理過程，在維持免疫反應的平衡及調控炎癥反應等過程中發(fā)揮重要的調控作用。miRNA-146a(MIMAT0000449)定位在于人染色體5q33-34。是一種與炎癥密切相關的miRNA，在T 淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞等多種免疫和炎癥細胞中高表達[3]，有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-146a 在類風濕關節(jié)炎患者滑膜成纖維細胞和滑膜組織中表達增多，從而加重了炎癥反應[4]。而在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內miRNA-146a 表達增多卻減輕了免疫炎癥反應[5]。

本文采用QRT-PCR 方法，檢測CP 患者血清中miRNA-146a 的表達情況，結果與健康對照組相比，在CP 中高表達，高表達的miRNA-146a 與性別、年齡沒有明顯關系，但與臨床分期有關，隨著疾病的加重而增高。提示miRNA-146a 可能與CP 的發(fā)生發(fā)展有關。

由于miRNA 功能的發(fā)揮是通過自身直接與靶基因相結合而實現(xiàn)的。miRNA 的靶基因參與某個生物學過程或者通路，就說明這個miRNA 參與調控這個生物學進程或通路，因此可以通過研究miRNA 靶基因的功能來研究該miRNA 的功能。本文通過靶基因預測分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-146a 的靶基因很多，4 個軟件同時預測出的靶基因數(shù)目沒有，3 個軟件預測出的靶基因有36 個。miRNA-146a 的靶基因參與細胞周期、信號轉導，細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化等各個方面的調控。與CP 相關的基因有6 個，TLR4、CTSC 是其中之一。

TLR4(Toll like receptor4)是Toll 樣受體家族成員之一， 能識別細菌的脂多糖(lipopoly-saccharides，LPS)，介導內毒素的信號轉導，并通過核因子-κB(nuclear factor-kappaB， NF-κB)通路引發(fā)炎癥反應[6]。于慧等[7]對638 例慢性牙周炎患者外周靜脈血提取基因組DNA，采用TaqMan MGB探針法對TLR2/ TLR4 共9 個多態(tài)性位點進行基因型檢測，證實TLR4 基因多態(tài)性與牙周炎的易感性有密切相關性，其單核苷酸多態(tài)性會影響牙周疾病嚴重程度的進展，導致更嚴重的炎癥應答損傷，引起牙周組織更嚴重的破壞。

組織蛋白酶C(cathepsin C ，CTSC)是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶。位于常染色體11q14.1-q14.3，全長約46kb，含有7 個外顯子和6 個內含子。它的主要功能是參與蛋白質降解、酶的活化以及多種免疫和炎癥反應。有研究表明CTSC 基因突變將導致其功能改變，蛋白活性喪失，從而抑制了對病原微生物引起的牙齦和牙周深部組織感染的免疫炎癥反應，最終導致牙齒脫落[8]。

綜上所述，miRNA-146a 可能通過對其靶基因的調控參與CP 的發(fā)生發(fā)展，具體機制尚需細胞學實驗進一步證實。

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