大豆異黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠種植體骨結(jié)合療效的評(píng)價(jià)*

張春光 晁 洋 宋 揚(yáng) 王慧媛 高菊榮

骨質(zhì)疏松癥是一種以全身骨量減少、骨組織破 壞為特征而導(dǎo)致骨脆性增加、骨折發(fā)生率增高的全身性骨骼疾病。尤其在絕經(jīng)期后婦女中，這種原發(fā)性的骨質(zhì)疏松癥已成為影響婦女健康的嚴(yán)重問題。雌激素水平降低，骨的快速丟失導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病的重要原因。絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松發(fā)病率是同齡男性的6 倍，而骨質(zhì)疏松又是口腔種植的相對(duì)禁忌癥。因此，促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥患者種植體骨結(jié)合成為廣大科研和臨床工作者的研究目標(biāo)。去卵巢大鼠是模擬絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松最成熟的動(dòng)物模型[1]，本研究選取4 月齡的雌性SD 大鼠進(jìn)行卵巢切除造成骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，并使用大豆異黃酮這種對(duì)絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松癥治療廣泛使用的藥物，比較不同劑量的大豆異黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠的種植體骨結(jié)合的影響， 以大鼠種植體骨結(jié)合率、松質(zhì)骨螺紋區(qū)骨面積為指標(biāo)，采用骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)手段，來研究不同劑量的大豆異黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松狀態(tài)下種植體骨整合的影響，并使用抗扭力脫位測(cè)試種植體骨結(jié)合的實(shí)際效果，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1. 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用品及儀器 純鈦種植體：5mm×2mm 螺紋柱狀光滑純鈦螺釘(西安中邦鈦制品有限公司)；大豆異黃酮(陜西錦泰生物工程有限公司)；扭矩測(cè)試儀(HP-10，廣東質(zhì)信電子有限公司)；微型馬達(dá)(LX-30FS，日本)；Olympus 多功能顯微鏡(TPH4-200，日本)；專業(yè)圖像分析軟件(Image-pro Plus 版本6.0)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建立 4 月齡SD雌性大鼠，戊巴比妥鈉麻醉后，在無菌條件下行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。經(jīng)腹背部肋緣下1cm，脊柱兩側(cè)各1.5cm 交界處，分別做1cm 左右切口進(jìn)入腹腔，結(jié)扎并切除雙側(cè)卵巢，術(shù)后肌注40 萬單位青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組不切除卵巢，只切除卵巢附近少量脂肪組織。

1.2.2 種植手術(shù) 卵巢切除手術(shù)后10 周，對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行種植手術(shù)。戊巴比妥鈉麻醉后，在大鼠雙側(cè)股骨遠(yuǎn)中干骺端分別植入純鈦螺紋釘1顆。

1.2.3 標(biāo)本的獲取 于種植手術(shù)后12 周處死實(shí)驗(yàn)大鼠，取其股骨遠(yuǎn)中段包含種植體的骨組織，用10%甲醛溶液固定送檢。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 4 月齡SPF 級(jí)雌性SD 大鼠40 只，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)，每5 只大鼠分一籠，室溫25℃，相對(duì)濕度60%-80%，自由飲食。按照大鼠體重排序后隨機(jī)區(qū)組分組方式共分為4 組：

Ⅰ，假手術(shù)組(Sham-ovariectomized rats，SHAM)：10 只，切除雙側(cè)卵巢旁等量脂肪組織后即縫合創(chuàng)口，未植入鈦螺紋釘。

Ⅱ，卵巢切除組(OVX)：10 只，行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。10 周后在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙側(cè)脛骨干骺端分別植入鈦螺紋釘1 顆。

Ⅲ，卵巢切除+ 低劑量大豆異黃酮組(OVX+SIL)：10 只，行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。10 周后在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙側(cè)脛骨干骺端分別植入鈦螺紋釘1顆。植入鈦螺紋釘后使用SI 藥物灌胃12 周，灌胃劑量為60mg/ kg。

Ⅳ，卵巢切除+ 高劑量大豆異黃酮組(OVX+SIH)：10 只，行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。10 周后在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙側(cè)脛骨干骺端分別植入鈦螺紋釘1顆。植入鈦螺紋釘后使用SI 藥物灌胃12 周，灌胃劑量為120mg/ kg。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法 實(shí)驗(yàn)開始第20 周后，處死全部大鼠并取材。每只實(shí)驗(yàn)大鼠左側(cè)股骨樣本進(jìn)行生物力學(xué)扭矩測(cè)試，右側(cè)股骨樣本進(jìn)行硬組織切片染色后行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)。

1.4.1 生物力學(xué)扭矩測(cè)試 將帶種植體的左側(cè)脛骨標(biāo)本，修整為15mm 長(zhǎng)，使其能恰當(dāng)卡入扭矩測(cè)試儀特制的夾具，扭力扳手固定在種植體頭部外露部分。沿逆時(shí)針方向用力，記錄種植體脫位松動(dòng)前的最大載荷值。

1.4.2 骨組織形態(tài)定量學(xué)檢測(cè) 將帶種植體的右側(cè)脛骨標(biāo)本，送樣進(jìn)行非脫鈣骨硬組織切片，將切片進(jìn)行亞甲基藍(lán)-堿性品紅染色后常規(guī)封片。將染色切片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，使用Image-pro Plus 軟件在大倍率視圖下：①標(biāo)出種植體外形輪廓線，測(cè)量輪廓線中有骨結(jié)合的部分的長(zhǎng)度和總長(zhǎng)度，計(jì)算出種植體骨結(jié)合率(Bone Contact Ratio of the implant，BCR)。②標(biāo)出種植體的兩個(gè)螺紋外形最外點(diǎn)，以該兩點(diǎn)相連的長(zhǎng)度為邊長(zhǎng)向骨內(nèi)區(qū)域畫出一正方形，計(jì)算該區(qū)域面積中礦化骨基質(zhì)的面積所占百分比，計(jì)算出松質(zhì)骨區(qū)骨量(Trabercular Area，TA)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 多標(biāo)本均數(shù)間的比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)資料的方差分析，計(jì)算結(jié)果以±s形式表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2. 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠狀況 去卵巢手術(shù)、種植體植入手術(shù)后至處死前，各組大鼠狀況均良好，卵巢切除及種植術(shù)后，所有大鼠創(chuàng)口愈合佳，無感染。

2.2 種植體生物力學(xué)扭矩測(cè)試 OVX+SIH組的脫位扭矩與SHAM 組無顯著性差異(P＞0.05)。其余各實(shí)驗(yàn)組扭矩值均較SHAM 組低，且P＜0.05(見表1)。

2.3 骨組織形態(tài)定量學(xué)檢測(cè) SHAM 組及OVX+SIH 、OVX+SIL 組的松質(zhì)骨區(qū)骨量、骨結(jié)合率均明顯高于OVX 組，比較差異有顯著性(P＜0.05)。其中，OVX+SIH 組的松質(zhì)骨區(qū)骨量、骨結(jié)合率均比OVX+SIL 組高，比較差異有顯著性(P＜0.05)(見表2)。

2.4 光鏡下觀察種植體-骨結(jié)合組織切片形態(tài) SHAM 組皮質(zhì)骨區(qū)的種植體骨結(jié)合界面骨板密集，骨與種植體結(jié)合緊密。松質(zhì)骨區(qū)種植體表面包繞骨質(zhì)較厚，連續(xù)性較好。松質(zhì)骨區(qū)骨小梁密集而連續(xù)，粗細(xì)均勻成網(wǎng)狀(見圖1A)。

OVX 組皮質(zhì)骨區(qū)種植體骨結(jié)合界面骨板較薄，連續(xù)性較差。松質(zhì)骨區(qū)種植體表面大部分在骨髓腔內(nèi)未與骨組織接觸，周圍有少量成團(tuán)的礦化組織，骨小梁稀疏(見圖1B)。

OVX+SIH、OVX+SIL 組皮質(zhì)骨區(qū)種植體骨結(jié)合界面緊密接觸，結(jié)合骨板連續(xù)性較好。松質(zhì)骨區(qū)包繞種植體的骨板厚度增加，排列成板狀。骨松質(zhì)區(qū)骨小梁比較粗大基本連接成網(wǎng)狀，介于以上兩組之間。OVX+SIL 與OVX+SIH 比較，皮質(zhì)骨區(qū)未見明顯區(qū)別，但骨小梁區(qū)排列欠規(guī)則，骨小梁較薄(見圖1C、D)。

表1 各組大鼠種植體脫位扭矩分析(N·cm)(±s，n=10)

表1 各組大鼠種植體脫位扭矩分析(N·cm)(±s，n=10)

注：△與OVX 組比較P＜0.05； ▲與OVX+SIL 組比較P＜0.05；☆與sham 組比較P＞0.05

組別 脫位扭矩 扭矩范圍Sham 組 21.2±3.5 18～24 OVX 組 12.5±2.7 9～15 OVX+SIL 組 16.6±3.1△ 13～20 OVX+SIH 組 19.8±2.9▲☆ 17～22

3. 討論

越來越多的老年骨質(zhì)疏松癥患者尋求種植牙修復(fù)缺失牙齒，但骨質(zhì)疏松癥患者種植牙的高失敗率使大量患者的需求難以滿足。國(guó)內(nèi)外目前的研究顯示，骨質(zhì)疏松癥對(duì)口腔種植的影響主要表現(xiàn)在種植區(qū)骨量減少、骨質(zhì)量變差和降低種植體骨結(jié)合率這兩方面。

表2 各組大鼠種植體骨結(jié)合情況(%)(±s，n=10)

表2 各組大鼠種植體骨結(jié)合情況(%)(±s，n=10)

注：△與OVX 組比較P＜0.05；▲與OVX+SIL 組比較P＜0.05；☆與sham 組比較P＜0.05

組別 骨結(jié)合率 松質(zhì)骨區(qū)骨量Sham 組 78.63±2.92 36.52±2.38 OVX 組 43.82±1.72 19.73±2.63 OVX+SIL 組 57.35±2.16△ 24.29±1.97△OVX+SIH 組 71.91±3.36▲☆ 32.83±1.64▲☆

圖1 硬組織切片染色(×10)

國(guó)內(nèi)外有許多學(xué)者實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用雌激素替代療法可以使骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物體內(nèi)的種植體的骨結(jié)合更加緊密，李曉紅等[2]使用雌激素和鈣制劑，對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠模型種植體界面骨愈合影響的實(shí)驗(yàn)顯示出，骨質(zhì)疏松癥降低了種植體和骨界面的早期骨愈合程度，而雌激素治療或者雌激素和鈣聯(lián)合治療都能增加種植體周圍骨的形成。雖然雌激素替代療法對(duì)骨質(zhì)疏松癥有較好療效，但其對(duì)乳腺和子宮等靶器官的不良影響也日益受到重視[3]。

大豆異黃酮由金雀異黃素(染料木黃酮)和大豆苷原兩種類雌激素物質(zhì)組成，是一種典型的植物雌激素[4]。其結(jié)構(gòu)與雌激素相似，具有弱雌激素樣作用，可防治骨質(zhì)疏松癥尤其是絕經(jīng)期婦女的骨質(zhì)疏松癥[5]，且對(duì)乳腺、子宮等器官無不良影響[6]。國(guó)內(nèi)外的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，東方女性的膳食中豆類食物的比重遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于西方女性，前者的骨折發(fā)生率也顯著低于后者[7]。之后的很多研究把大豆異黃酮作為雌激素替代物防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。Arjmandi 等[8]的研究報(bào)道大豆蛋白可抑制去卵巢模型大鼠的股骨及腰椎骨的骨密度降低， 并證實(shí)大豆異黃酮是大豆蛋白發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的有效成分。Ishida 等[9]報(bào)道大豆異黃酮中DAI 和GEN 成分可有效防止骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨骨密度、強(qiáng)度、灰重及鈣磷含量的下降。后來， Ishimi 等[10]研究發(fā)現(xiàn)GEN 可抑制OVX 小鼠的骨丟失而沒有出現(xiàn)作用于子宮的雌激素樣作用。

在本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，OVX 組不僅種植體骨結(jié)合率、松質(zhì)骨螺紋區(qū)骨面積低于SHAM 組，而且骨小梁形態(tài)很差，種植體周圍結(jié)合骨板量非常少，從而減弱了骨組織對(duì)種植體的支持，使種植體的抗脫位扭矩與SHAM 組有較大差距。OVX+SIL 組組織學(xué)觀察示：皮質(zhì)骨區(qū)和松質(zhì)骨區(qū)種植體都與較多的骨組織接觸，只有部分與骨髓腔直接相連，達(dá)到了較好的骨結(jié)合狀況。通過給藥量的增加，OVX+SIH 組的組織學(xué)觀察己經(jīng)與SHAM 組相似，皮質(zhì)骨區(qū)和松質(zhì)骨區(qū)種植體都與礦化良好的板狀骨組織緊密接觸，種植體在骨髓腔部分也被骨板包繞，雖然骨計(jì)量學(xué)檢測(cè)與SHAM 組相比有顯著性差異，但通過生物力學(xué)扭矩測(cè)試，兩組已無顯著性差異，達(dá)到了良好的骨結(jié)合狀況。

綜合以上結(jié)果說明，大豆異黃酮有劑量依賴性地改善種植體周圍骨質(zhì)量的可能性，大豆異黃酮可以有效改善種植體周圍骨質(zhì)量，增強(qiáng)骨質(zhì)疏松大鼠鈦螺紋釘?shù)墓墙Y(jié)合強(qiáng)度，增強(qiáng)疏松狀態(tài)下種植體的穩(wěn)定性，并存在劑量依賴性。

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