骨形成蛋白-4 對(duì)小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞牙向分化能力的影響*

劉 麗 王紅雷 陳增力 金 巖

組織工程化牙齒的研究打破了以往口腔科治療牙齒疾病的框架，以生物技術(shù)取代傳統(tǒng)的修復(fù)技術(shù)，將經(jīng)典發(fā)育學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與基因研究技術(shù)相結(jié)合，在體內(nèi)外構(gòu)建有功能的生物活性牙齒。因此獲取具有成牙潛能且來(lái)源豐富的種子細(xì)胞；探討不同細(xì)胞分化的微環(huán)境成為當(dāng)前牙齒組織工程研究的幾個(gè)主要問(wèn)題。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem， iPS)的出現(xiàn)為人類(lèi)帶來(lái)了新的希望，在干細(xì)胞領(lǐng)域和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有重要的意義[1]。iPS 的研究一方面解決了利用胚胎進(jìn)行干細(xì)胞研究的道德?tīng)?zhēng)議，另一方面也使得干細(xì)胞研究的來(lái)源更不受限[2]。

骨形成蛋白(BMP， bone morphogenetic protein)屬于分泌型信號(hào)分子TGF-β 超家族成員，在中胚層誘導(dǎo)以及器官形成中起重要作用[3]。已經(jīng)證實(shí)，骨形成蛋白-4(BMP4)在牙齒發(fā)育的起始起著決定性的關(guān)鍵作用[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外模擬BMP4 生長(zhǎng)因子微環(huán)境，研究BMP4 對(duì)iPS 細(xì)胞向牙源性細(xì)胞遷移的方向及潛能的影響，為iPS 牙向分化微環(huán)境的構(gòu)建提供新的思路，也為進(jìn)一步模擬體內(nèi)成牙微環(huán)境定向誘導(dǎo)iPS 牙向分化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1. 材料與方法

1.1 材料 小鼠iPS-C5 細(xì)胞株購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院；高糖DMEM(Gibco 公司，美國(guó))；滅活胎牛血清(Gibco 公司，美國(guó))；非必須氨基酸(Gibco 公司，美國(guó))；丙醇酸鈉(Gibco 公司，美國(guó))；2-巰基乙醇(Gibco 公司，美國(guó))；白血病抑制因子(LIF，Gibco 公司，美國(guó))；抗小鼠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-4(OCT4，Santa Cruz Biotechnology 公司，美國(guó))；干細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原-4(SSEA4，Santa Cruz Biotechnology 公司，美國(guó))一抗；抗小鼠成釉蛋白(AMBN，Santa Cruz Biotechnology 公司，美國(guó))；釉原蛋白(AMGN，Santa Cruz Biotechnology 公司，美國(guó))；細(xì)胞角蛋白-14(CK14，Bioworld Technology 公司，美國(guó))；牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1(DMP-1，Santa Cruz Biotechnology 公司，美國(guó))；牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSP，Santa Cruz Biotechnology 公司，美國(guó)）一抗；Hoechst 33342(Sigma 公司，美國(guó))；RNA抽提試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas 公司，美國(guó))；Taq DNA 聚合酶、dNTPs 和引物(上海生物工程公司，中國(guó))；PDVF 膜；電泳緩沖液；轉(zhuǎn)移緩沖液；Tween 20；封閉液；解離液；化學(xué)發(fā)光Western Blot 試劑盒(Pierce 公司，美國(guó))；BMP4(R＆D System， 美國(guó))；noggin(Peprotech，美國(guó))。

1.2 iPS 細(xì)胞培養(yǎng) iPS 細(xì)胞接種、傳代前準(zhǔn)備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)作為滋養(yǎng)層，絲裂霉素C 進(jìn)行滅活處理。iPS 細(xì)胞培養(yǎng)在預(yù)先鋪有滋養(yǎng)層細(xì)胞和0.1% 明膠的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1 次，每2-3d 傳代1 次[5]。

1.3 EB 培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 將消化下來(lái)的iPS細(xì)胞吹打至單個(gè)細(xì)胞，用無(wú)LIF 的iPS 培養(yǎng)液作為EB 培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)2d，收集培養(yǎng)2d 的EB，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。A 組：對(duì)照組，EB 培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。B 組：成釉細(xì)胞無(wú)血清條件培養(yǎng)液(ASF-CM)培養(yǎng)EB 14d。C 組：ASF-CM 中加入50ng/ ml BMP4(ASF-BMP4)。D 組：ASF-CM 中加入250 ng/ ml Noggin(ASF-Noggin)培養(yǎng)EB 14d。四組細(xì)胞在鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中貼壁生長(zhǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4 免疫熒光 去除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 清洗，4%多聚甲醛固定15min，0.25%Triton X-100 孵育15min，4%山羊血清封閉30min 后，分別加入AMBN 抗體(1∶100)、AMGN 抗體(1∶100)、CK14 抗 體(1 ∶100)、DMP-1(1 ∶100)、DSP(1∶100)，4℃過(guò)夜。PBS 清洗3 次，加入Rhodamine 標(biāo)記的熒光二抗(1∶200)。 PBS 清洗3 次，DAPI 復(fù)染3min，置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 Western Blot 檢測(cè) 在細(xì)胞培養(yǎng)7d 和14d 時(shí)利用細(xì)胞裂解液試劑盒提取各誘導(dǎo)組和對(duì)照組總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度。制備SDS 電泳液，以恒壓80V(濃縮膠)/ 130V(分離膠)進(jìn)行蛋白上樣。轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉緩沖液封閉PVDF 膜。稀釋一抗(AMBN、AMGN、DMP-1、DSP 一抗稀釋比例1∶500，β-actin 稀釋比例：1∶1000)，4℃過(guò)夜。次日，TBST 緩沖液洗膜3 次，按1∶1000 比例稀釋二抗，孵育2h。加入電化學(xué)發(fā)光底物發(fā)光顯色試劑盒顯色，蛋白凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。

1.6 RT-PCR 檢測(cè) Trizol 裂解并提取iPS細(xì)胞總RNA。測(cè)定RNA 濃度，分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA 利用Syber Green 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，目的基因及管家基因在不同的反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系均為201ul，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95℃變性20min，95℃30s，60℃1min，40 個(gè)循環(huán)。T7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀監(jiān)測(cè)記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由軟件自動(dòng)計(jì)算后得出。驗(yàn)證該方法的重復(fù)性和擴(kuò)增效率。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；P＜0.05 認(rèn)為差異有顯著性。

2. 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 EB 與ASFBMP4 共培養(yǎng)2d 后，EB 開(kāi)始不規(guī)則，EB 的外周開(kāi)始有細(xì)胞爬出，呈現(xiàn)以EB 為中心，向四周放射狀生長(zhǎng)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖較快，14d 后類(lèi)似上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底。EB 與ASF-Noggin 共培養(yǎng)14d 后，分化的細(xì)胞呈不規(guī)則的長(zhǎng)梭樣，沒(méi)有觀察到鵝卵石樣上皮細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞形成(圖1)。

圖1 iPS 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

2.2 誘導(dǎo)后細(xì)胞蛋白水平表達(dá) EB 與ASFBMP4 共培養(yǎng)14d 后，分化的細(xì)胞形態(tài)學(xué)上觀察類(lèi)似于上皮樣細(xì)胞以及成纖維樣細(xì)胞。為了進(jìn)一步證明分化的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，我們使用了細(xì)胞免疫染色和Western Blot 方法從蛋白水平檢測(cè)細(xì)胞的表型。細(xì)胞免疫染色結(jié)果顯示：EB 與ASF-BMP4共培養(yǎng)14d 后，分化的細(xì)胞不僅陽(yáng)性表達(dá)成釉細(xì)胞特異性標(biāo)記物AMBN、AMGN 以及上皮標(biāo)記物CK14，而且成牙本質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物DMP-1、DSP表達(dá)也陽(yáng)性；ASF-CM 組主要表達(dá)AMBN、AMGN、CK14(圖2)。Western Blot 結(jié)果顯示：在培養(yǎng)7 天時(shí)，ASF-CM 組AMBN、AMGN、DMP-1、DSP 表達(dá)均不明顯，與對(duì)照組接近。在培養(yǎng)14 天時(shí)，ASF-BMP4 組陽(yáng)性表達(dá)AMBN、AMGN、DMP-1、DSP，并且表達(dá)明顯高于ASF-CM 組，ASF-Noggin 組各基因表達(dá)均低于ASF-CM 組(圖3)。

圖2 誘導(dǎo)14d 后，分化的iPS 細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果

圖3 不同條件培養(yǎng)液ASF-CM/ ASF-BMP4/ASF-Noggin 誘導(dǎo)iPS 細(xì)胞，在培養(yǎng)7d 和14d Western blot 檢測(cè)AMBN、AMGN、DSP、DMP-1 的表達(dá)。

2.3 誘導(dǎo)后細(xì)胞基因水平表達(dá) EB 與ASFCM/ ASF-BMP4/ ASF-Noggin 共培養(yǎng)，PR-PCR檢測(cè)牙齒相關(guān)的一些重要基因的表達(dá)，未經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的iPS 細(xì)胞作為對(duì)照組。RT-PCR 結(jié)果顯示：隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，ASF-BMP4 誘導(dǎo)的iPS 細(xì)胞AMBN、DMP-1、DSPP 基因的表達(dá)顯著增高；在7 天和14 天相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)這些基因的表達(dá)ASF-BMP4 顯著 高 于 ASF-CM 組， ASF-Noggin 組 與ASF-CM 組相比，這些基因的表達(dá)明顯降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；誘導(dǎo)14 天后，ASF-CM 組、ASFBMP4 組分化的細(xì)胞AMBN、DMP-1、DSPP 基因表達(dá)與對(duì)照組相比均有顯著差異，ASF-Noggin組AMBN、DMP-1、DSPP 基因表達(dá)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(圖4)。

圖4 不同誘導(dǎo)環(huán)境ASF-CM/ ASF-BMP4/ ASF-Noggin 誘導(dǎo)iPS 后，在培養(yǎng)7d 和14d RT-PCR檢測(cè)AMBN、DMP-1、DSPP 的表達(dá)(*P＜0.05，**P＜0.01)。

3. 討論

器官發(fā)育從始至終分化主要依賴(lài)于上皮與其周?chē)g充質(zhì)一系列信號(hào)分子之間的相互作用、相互誘導(dǎo)。牙齒的發(fā)育亦是如此。這些信號(hào)分子包括生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子。生長(zhǎng)因子是由細(xì)胞分泌的一類(lèi)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的生物活性多肽，通常以自分泌或旁分泌的方式作用于組織細(xì)胞，其作用機(jī)制是：生長(zhǎng)因子與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活胞漿內(nèi)蛋白激酶、使其發(fā)生磷酸化，作用與細(xì)胞核內(nèi)的目的基因，引起細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)。生長(zhǎng)因子不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移、分化，有些因子還起到抑制的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多生長(zhǎng)因子參與牙齒發(fā)育過(guò)程中上皮-間充質(zhì)之間的信號(hào)調(diào)控，主要包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、骨形成蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因-β(TGF-β)以及Wnts 家族等[6]。

BMPs 是口腔上皮中最早表達(dá)的信號(hào)分子之一，在上皮－間充質(zhì)的相互誘導(dǎo)中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[7]。在胚胎的11.5d，牙上皮中的生長(zhǎng)因子(BMP4、FGF8、Shh 等)旁分泌到下方的間充質(zhì)中，激活間充質(zhì)中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)(Msx1、Msx2、Pax9、Dlx1、Dlx2 等)[8]。在胚胎的14.5d，BMP4信號(hào)主要在牙間充質(zhì)中表達(dá)，調(diào)控著牙間充質(zhì)細(xì)胞的聚集和分化，而作為反饋信號(hào)，BMP4 又作用于牙上皮細(xì)胞，促進(jìn)牙上皮細(xì)胞形成成釉器[9]。近期國(guó)外研究表明BMP2 能促進(jìn)牙髓干細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞[10-11]，在此分化過(guò)程中BMP2 促進(jìn)了Smad1/ 5 的磷酸化和核轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。還有研究表明BMP4 能影響胎鼠成骨作用和成牙本質(zhì)細(xì)胞分化[13]。本實(shí)驗(yàn)研究表明BMP4 能促進(jìn)iPS 細(xì)胞向成釉細(xì)胞譜系和成牙本質(zhì)細(xì)胞譜系分化， BMP4 在iPS 牙向分化過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。但是BMP4 的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚，將是我們今后研究的重點(diǎn)。

Noggin 是BMPs 的特異性拮抗劑，能以較高的粘合力與BMPs 結(jié)合，從而阻止它們與其受體結(jié)合。Noggin 和BMPs 高效結(jié)合后會(huì)形成一個(gè)較大的戒指樣結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可使Noggin 有效的將BMPs 上的受體結(jié)合位點(diǎn)遮蔽，從而抑制BMPs 與其受體結(jié)合，進(jìn)而阻止Smad 依賴(lài)性和非Smad依賴(lài)性信號(hào)通路的傳導(dǎo)，拮抗BMPs 的功能，從而阻斷BMP 受體信號(hào)通路[14]。本研究結(jié)果表明Noggin 對(duì)iPS 細(xì)胞的牙向分化起抑制作用。Western Blot 和RT-PCR 結(jié)果顯示iPS 細(xì)胞經(jīng)ASF-BMP4 培養(yǎng)后AMBN、DPM-1、DSPP 表達(dá)顯著增高，經(jīng)過(guò)ASF-Noggin 培養(yǎng)后AMBN、DMP-1、DSPP 表達(dá)明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。外源性的BMP4 放大了ASF-CM 中內(nèi)源性BMP4的作用，激活了BMP4 信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而促進(jìn)iPS 細(xì)胞向牙源性細(xì)胞譜系分化，而Noggin 通過(guò)阻斷BMP 信號(hào)通路，抑制iPS 細(xì)胞的分化。

綜上所述，我們前期研究探討了小鼠iPS 細(xì)胞作為組織工程牙齒再生研究的種子細(xì)胞的可行性。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上深入探討B(tài)MP4 對(duì)iPS細(xì)胞牙向分化的影響和作用，優(yōu)化了iPS 牙向分化的誘導(dǎo)條件，為組織工程牙齒再生研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而且對(duì)機(jī)體其它器官的發(fā)育與再生提供有益參考。

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