殼層隔絕納米粒子增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織的生物學(xué)特點(diǎn)及其臨床意義

張海鵬,吳 迪,張 湜,付 彤,路 璐,范志民,鄭 超,韓 冰

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院產(chǎn)科,吉林長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院乳腺外科,吉林長(zhǎng)春 130021)

殼層隔絕納米粒子增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織的生物學(xué)特點(diǎn)及其臨床意義

張海鵬1,吳 迪2,張 湜?,付 彤2,路 璐2,范志民2,鄭 超2,韓 冰2

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院產(chǎn)科,吉林長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院乳腺外科,吉林長(zhǎng)春 130021)

目的:采用殼層隔絕納米粒子增強(qiáng)拉曼光譜(SHINERS)技術(shù)檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC)組織和正常乳腺組織,探討乳腺IDC的光譜學(xué)特點(diǎn)、生物學(xué)特征和鑒別方法。方法:收集行乳腺外科手術(shù)患者的乳腺組織冰凍切片,共24例,均為女性,年齡27～59歲;其中乳腺IDC組織15例,正常乳腺組織9例。冰凍切片解凍后先行普通拉曼光譜檢測(cè),加殼層隔絕納米粒子(SHINs)后再次檢測(cè)。共收集了263個(gè)拉曼光譜和249個(gè)SHINERS光譜,所有光譜均進(jìn)行基線修正擬合,再將所有的光譜用Adjacent-Averaging算法進(jìn)行15點(diǎn)平滑。結(jié)果:正常乳腺組織特征峰出現(xiàn)在1 090、1 157、1 262、1 300、1 442、1 658、1 745和1 874 cm－1;在加入SHINs后,少數(shù)特征峰的峰位出現(xiàn)2～3 cm－1位移,其中1 090和1 157 cm－1相對(duì)強(qiáng)度明顯增加,出現(xiàn)1 496 cm－1特征峰。乳腺IDC組織普通拉曼光譜檢測(cè)可見多個(gè)核酸特征峰(包括878、1 086和1 157 cm－1);加入SHINs后,明顯看到1 004、1 157、1 526和1 658 cm－1相對(duì)強(qiáng)度增加,脂類的特征峰1 745和1 442 cm－1為C＝O和CH2伸縮振動(dòng),IDC組織相對(duì)于正常組織表現(xiàn)出2～3 cm－1的藍(lán)移;類胡蘿卜素的特征峰出現(xiàn)在1 527 cm－1;核酸的特征峰1 090 cm－1藍(lán)移至1 086 cm－1。結(jié)論:拉曼光譜能夠發(fā)現(xiàn)乳腺IDC組織DNA、蛋白質(zhì)及類胡蘿卜素與正常乳腺組織的差異。SHINERS對(duì)不同類型的乳腺組織最大增強(qiáng)的特征峰不同,可以用來(lái)區(qū)分乳腺IDC組織和正常乳腺組織。

乳腺腫瘤;拉曼光譜;表面增強(qiáng)拉曼光譜;浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌

拉曼光譜分析技術(shù)是以拉曼效應(yīng)為基礎(chǔ)建立起來(lái)的分子結(jié)構(gòu)表征技術(shù),其信號(hào)來(lái)源于分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)[1],拉曼光譜分析在生物學(xué)領(lǐng)域研究中的突出優(yōu)點(diǎn)使其成為近年來(lái)應(yīng)用最多的一種研究手段。拉曼光譜的分析方法不需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理,操作簡(jiǎn)便,測(cè)定時(shí)間短,靈敏度高,有利于臨床即時(shí)檢測(cè);拉曼光譜檢測(cè)后的組織仍可以進(jìn)行病理學(xué)檢查,有利于檢測(cè)結(jié)果與病理結(jié)果的對(duì)比研究[2-3]。但由于生物樣品的拉曼譜峰具有強(qiáng)的熒光背景和復(fù)雜的成分等特點(diǎn),得到質(zhì)量高可分析的拉曼譜圖相對(duì)比較困難。田中群等[4]合成了一種全新的增強(qiáng)粒子——?dú)痈艚^納米粒子(SHINs),發(fā)明了基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的一種新技術(shù),即殼層隔絕納米粒子增強(qiáng)光譜(SHINRES)方法,并將其應(yīng)用于生物樣本的檢測(cè),取到很好的效果,目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)將該方法應(yīng)用于乳腺病變組織檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。本研究采用SHINRES方法檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC)組織和正常乳腺組織,通過拉曼光譜結(jié)果的差異探討乳腺IDC光譜學(xué)特點(diǎn),為鑒別病變性質(zhì)和進(jìn)一步研究病變機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2011年5月—2012年5月吉林大學(xué)第一醫(yī)院乳腺外科手術(shù)患者的乳腺組織冰凍切片,共24例,均為女性,年齡27～59歲;其中乳腺IDC組織15例(年齡31～74歲,中位年齡51.6歲),正常乳腺組織9例(年齡27～59歲,中位年齡40.3歲)。所有患者均同意參加本研究。手術(shù)后,樣本立即送至吉林大學(xué)第一醫(yī)院病理科,并在－25℃～－20℃條件下冰凍,而后通過冷凍切片機(jī)(LEICA-CM3050S,德國(guó))切成6μm厚連續(xù)冰凍切片。每個(gè)患者均切取1個(gè)樣本且每個(gè)樣本僅切取2張冰凍切片。其中1張連續(xù)冰凍切片經(jīng)HE染色后由1位乳腺癌病理學(xué)專家進(jìn)行常規(guī)組織病理學(xué)診斷;另一張連續(xù)冰凍切片在液氮中送往實(shí)驗(yàn)室。分析之前,冰凍切片在實(shí)驗(yàn)室室溫22℃下解凍10 min,光譜采集期間用生理鹽水(p H7.4)保持濕潤(rùn)。每張切片均收集多個(gè)光譜,但由于一些腫瘤組織樣本切片中含有正常和病變區(qū)域,因此本研究利用已染色的HE組織病理學(xué)切片,只收集病變區(qū)域的光譜數(shù)據(jù)。本文作者收集數(shù)據(jù)的組織樣本切片中的確切區(qū)域,在進(jìn)行病理診斷時(shí)以其最高級(jí)定義。

1.2 拉曼光譜檢測(cè)使用具有3λ空間分辨率、20 m W、633 nm的氦氖激光作為激發(fā)光的共聚焦拉曼系統(tǒng)收集拉曼光譜。拉曼散射光的收集使用50倍顯微鏡物鏡用于激發(fā)光的聚焦。激光聚焦在組織上的光斑大小為2μm。強(qiáng)烈的瑞利散射光被4-notch過濾器過濾。掃描光譜范圍為600～2 000 cm－1,積分時(shí)間為60 s,累積次數(shù)為3次。波數(shù)校準(zhǔn)設(shè)置參照硅片520.7 cm－1振動(dòng)頻率。所有的光譜測(cè)量均保持這些設(shè)置。

1.3 數(shù)據(jù)采集從HE染色切片中找到腫瘤位置,收集其連續(xù)冰凍切片中相同位置的拉曼光譜。每個(gè)樣品中從不同位置收集10～12個(gè)光譜,以確保代表性取樣和收集變化的信號(hào)。收集普通拉曼光譜后,將SHINs(由廈門大學(xué)田中群院士課題組提供)滴加到冷凍切片的表面,之后收集SHINERS光譜。共收集了來(lái)源于不同組織的263個(gè)拉曼光譜和249個(gè)SHINERS光譜,其中正常乳腺組織共收集103個(gè)拉曼光譜和92個(gè)SHINERS光譜,乳腺IDC組織共收集160個(gè)拉曼光譜和157個(gè)SHINERS光譜。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有光譜均進(jìn)行基線修正擬合,再減去一個(gè)三階多項(xiàng)式。將所有光譜用Adjacent-Averaging算法進(jìn)行15點(diǎn)平滑。

2 結(jié)果

觀察正常乳腺組織冰凍切片的普通拉曼光譜和SHINERS的平均光譜圖(圖1,見插頁(yè)五)以及相應(yīng)的HE染色(圖2A,見插頁(yè)五)、冰凍切片(圖2B,見插頁(yè)五)和滴加SHINs后的病理學(xué)圖像(圖2C,見插頁(yè)五),普通拉曼光譜可見特征峰出現(xiàn)在1 090、1 157、1 262、1 300、1 442、1 658、 1 745和1 874 cm－1,其中大多數(shù)為脂類特征峰和蛋白質(zhì),如膠原蛋白的特征峰。加入SHINs后,由于所處環(huán)境的改變,少數(shù)特征峰的峰位會(huì)有2～3 cm－1位移,其中1 090和1 157 cm－1相對(duì)強(qiáng)度明顯增加,出現(xiàn)1 496 cm－1特征峰,這3個(gè)特征峰歸屬為脂類和核酸中的O-P-O和C-C鍵。

觀察乳腺IDC組織冰凍切片的普通拉曼光譜和SHINERS的平均光譜圖(圖3,見插頁(yè)五)以及相應(yīng)的HE染色(圖4A,見插頁(yè)五)、冰凍切片(圖4B,見插頁(yè)五)和滴加SHINs后的病理學(xué)圖像(圖4C,見插頁(yè)五),普通拉曼光譜可見有多個(gè)核酸特征峰(包括878、1 086和1 157 cm－1),通過蛋白質(zhì)特征峰可見大量的氨基酸殘基(色氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸)。加入SHINs后,明顯看到1 004、1 157、1 526和1 658 cm－1相對(duì)強(qiáng)度增加。各特征峰歸屬見表1。

表1 正常乳腺組織和乳腺IDC組織拉曼光譜特征峰的歸屬Tab.1 Assignments of special peaks of Raman spectra of normal breast tissue and breast IDC tissue

對(duì)于脂類的特征峰,1 745和1 442 cm－1左右為C＝O和CH2伸縮振動(dòng),乳腺IDC組織相對(duì)于正常組織表現(xiàn)出2～3 cm－1的藍(lán)移;類胡蘿卜素的特征峰出現(xiàn)在1 527 cm－1;核酸的特征峰中, 1 090 cm－1藍(lán)移至1 086 cm－1。蛋白和核酸特征峰增強(qiáng)前后光譜峰的比值見表2。其中1 262、1 445和1 748 cm－1為脂類的特征峰,1 004和1 658 cm－1為蛋白質(zhì)的特征峰,880、1 086和1 157 cm－1為核酸的特征峰。

表2 正常乳腺組織和乳腺IDC組織中脂類、蛋白和核酸的特征峰增強(qiáng)前后的光譜絕對(duì)峰值比值Tab.2 Ratios of absolute values of spectrum of characteristic peaks of lipid,protein and nucleic acid before and after enhancement in normal breast tissue and breast IDC tissue

3 討論

拉曼光譜對(duì)水環(huán)境干擾小。可以從分子水平反映結(jié)構(gòu)組分的變化和差異,是一種具有高靈敏度的無(wú)損檢測(cè)方法。拉曼光譜的激發(fā)波長(zhǎng)和激光能量密度不破壞組織,并且有相對(duì)大的穿透深度,所以適合進(jìn)行體內(nèi)檢測(cè)[5-6]。在病變的初期拉曼光譜即可發(fā)現(xiàn)其分子細(xì)微的生物學(xué)組分改變[7],可用于腫瘤的早期診斷,因而顯示其具有廣泛的應(yīng)用前景。對(duì)于正常乳腺組織,在加入SHINs后,由于所處環(huán)境的改變,少數(shù)特征峰的峰位發(fā)生2～3 cm－1位移,其中1 090和1 157 cm－1相對(duì)強(qiáng)度明顯增加,并出現(xiàn)了新的特征峰,即1 496 cm－1,這3個(gè)特征峰可歸屬為脂類和核酸中的O-P-O和C-C 鍵,由此可以推斷出SHINs對(duì)上述2種化學(xué)鍵有明顯的增強(qiáng)作用。本研究在其他特征峰中, 1 262 cm－1為蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)中的酰胺Ⅲ和酰胺Ⅰ,未觀察到非常明顯的核酸特征峰,可見正常乳腺組織中細(xì)胞比較完整,代謝及復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等分裂過程正常,未出現(xiàn)病變無(wú)限制繁殖及凋亡現(xiàn)象。

本研究結(jié)果顯示:在乳腺IDC組織普通光譜中可以看到多個(gè)核酸特征峰(878、1 086和1 157 cm－1),而蛋白質(zhì)特征峰則均可見大量的氨基酸殘基(色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸)[8-9],可能因其惡性病變后細(xì)胞非正常的分裂繁殖,使氨基酸殘基逐漸增多,這是細(xì)胞的非正常代謝所導(dǎo)致的直接結(jié)果[10-11];在加入SHINs后,可明顯看到1 004、1 157、1 526和1 658 cm－1相對(duì)強(qiáng)度增加,這些特征譜線可歸屬為氨基酸殘基苯丙氨酸、類胡蘿卜素、核酸中的嘌呤和酰胺Ⅰ。在正常組織中,酰胺Ⅰ特征譜線比較明顯,在惡性病變中卻觀察不到酰胺Ⅰ特征譜線,但經(jīng)過SHINs增強(qiáng),可以觀察到比較明顯的特征譜線,所以可以推斷在惡性病變中存在酰胺Ⅰ帶特征峰。對(duì)于脂類的特征峰, 1 745和1 442 cm－1左右為C＝O和CH2伸縮振動(dòng),乳腺IDC組織相對(duì)于正常組織表現(xiàn)出2～3 cm－1的藍(lán)移,該變化可能由于細(xì)胞癌變過程中脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致[12];而就蛋白特征峰而言, 665 cm－1歸屬于氨基酸的C-S伸縮振動(dòng),只出現(xiàn)在IDC組織中;類胡蘿卜素的特征峰,1 527 cm－1C＝C伸縮振動(dòng)只有在IDC組織中表現(xiàn)的比較明顯,在其他組織中幾乎觀察不到。Shafer-Pelitier 等[11]在其所建立的人乳腺組織顯微光譜模型中觀察到類胡蘿卜素未顯示出或顯示較小的特異性,并不能被視為區(qū)分正常、良性和惡性乳腺組織的標(biāo)志,而本研究結(jié)果表明:類胡蘿卜素的拉曼光譜是惡性腫瘤表現(xiàn)出的關(guān)鍵特征。核酸的特征峰中,1 090 cm－1左右是DNA的磷酸骨架伸縮振動(dòng)譜線,一旦DNA發(fā)生單、雙鏈的斷裂,該譜線強(qiáng)度下降并會(huì)發(fā)生位移。乳腺IDC組織中該峰藍(lán)移至1 086 cm－1,說(shuō)明在癌變組織中部分DNA的單雙鏈已開始斷裂。比較正常乳腺組織和乳腺IDC組織的普通拉曼光譜特征可以發(fā)現(xiàn):其光譜特征表現(xiàn)出很大的相似性,可能由于2種組織主要的化學(xué)成分相同,主要為脂類、蛋白質(zhì)、核酸和胡蘿卜素。同時(shí),2種乳腺組織的普通拉曼光譜表現(xiàn)出一些差異,可以為區(qū)分乳腺組織提供一種手段。但由于乳腺組織本身具有強(qiáng)的熒光背景和復(fù)雜的化學(xué)成分,再加上普通拉曼光譜其靈敏度低,有時(shí)很難得到乳腺組織的普通拉曼光譜。因此,為了獲得更詳細(xì)和有效的信息來(lái)區(qū)分2種乳腺組織,本文作者利用SHINs增強(qiáng)得到了SHINERS,將其與普通拉曼光譜對(duì)比顯示:拉曼信號(hào)強(qiáng)度得到了一定的增強(qiáng),說(shuō)明SHINERS可以為區(qū)分乳腺疾病提供更有效的信息。

為了利用SHINERS進(jìn)一步區(qū)分2種乳腺組織,本研究采用SHINs對(duì)各個(gè)組織的主要化學(xué)成分包括脂質(zhì)、蛋白和核酸特征峰的具體增強(qiáng)效果進(jìn)行比較。SHINs對(duì)不同乳腺組織的同類特征峰表現(xiàn)出了不同程度的增強(qiáng)。脂類的特征峰中,正常乳腺組織的1 745 cm－1左右C＝O伸縮振動(dòng)增強(qiáng)效果最明顯,1 262 cm－1左右＝C-H平面振動(dòng)增強(qiáng)效果最差。而乳腺IDC組織中,SHINs對(duì)1 442 cm－1脂類的CH2伸縮振動(dòng)增強(qiáng)效果最強(qiáng),對(duì)1 262和1 748 cm－1的增強(qiáng)效果相似。根據(jù)表面選擇性規(guī)則,垂直于金屬基底表面的振動(dòng)模式能得到很大的增強(qiáng),而平行于金屬基底表面的振動(dòng)模式增強(qiáng)較小[4,13-14]。由此可以推斷:在正常乳腺組織和乳腺IDC組織中,脂類的C＝O伸縮振動(dòng)垂直吸附于SHINs表面,＝C-H平面振動(dòng)可能平行吸附于SHINs表面,而導(dǎo)致出現(xiàn)不同程度的增強(qiáng)效果。SHINs對(duì)2種組織的1 658 cm－1蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ帶和α-螺旋均表現(xiàn)出較強(qiáng)的增強(qiáng)效果,卻對(duì)正常組織中1 004 cm－1的苯丙氨酸對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)[15]表現(xiàn)出減弱的作用,對(duì)乳腺IDC組織的該特征峰表現(xiàn)出一定的增強(qiáng)作用。事實(shí)上,苯丙氨酸一直被認(rèn)為是細(xì)胞增殖不受控制的標(biāo)志,其廣泛存在于纖維腺瘤中的膠原纖維形成及腫瘤癌變?cè)鲋车冗^程,在此表現(xiàn)出的增強(qiáng)效果的差異尚需進(jìn)一步研究。

核酸不僅是重要的基本遺傳物質(zhì),而且在合成蛋白質(zhì)的過程中還起著重要的作用,SHINs對(duì)正常乳腺組織中核酸的各個(gè)特征峰增強(qiáng)效果類似,而對(duì)于乳腺IDC組織,880 cm－1表現(xiàn)出比較強(qiáng)的增強(qiáng)效果。SHINs對(duì)每種組織均有1個(gè)特征峰的最大增強(qiáng)。在乳腺IDC組織中,880 cm－1歸屬于DNA的核糖的特征峰得到了最大程度的增強(qiáng),其增強(qiáng)倍數(shù)為10。而對(duì)于正常乳腺組織得到最大增強(qiáng)的是1 745 cm－1左右脂類C＝O伸縮振動(dòng)峰,其增強(qiáng)倍數(shù)僅為3.5。

本研究結(jié)果顯示:SHINs對(duì)乳腺組織的增強(qiáng)效果并不是特別好,可能是由于SHINs作為SHINERS增強(qiáng)基底,增強(qiáng)機(jī)制主要為電磁場(chǎng)增強(qiáng),而電磁場(chǎng)增強(qiáng)涉及的分子與金屬的作用為物理吸附[4,13-14],乳腺組織的成分比較復(fù)雜,表面不能很好地吸附納米粒子,使分子不能很好地吸附在納米粒子周圍而影響了其增強(qiáng)效果,使其低于文獻(xiàn)報(bào)道的SiO2層為2和4 nm時(shí),可分別增強(qiáng)142和85倍。但是對(duì)拉曼光譜的最大增強(qiáng)效果仍舊可以達(dá)到10倍左右,這在一定程度上可以提高拉曼光譜對(duì)乳腺組織檢測(cè)的靈敏度。

綜上所述,拉曼光譜可以在分子水平上反映乳腺組織生化成分的結(jié)構(gòu)變化和差異,為乳腺疾病的診斷提供了一種有效的光譜手段。拉曼光譜能夠發(fā)現(xiàn)乳腺IDC組織DNA、蛋白質(zhì)及類胡蘿卜素與正常乳腺組織之間的差異,為癌變機(jī)制研究提供一種可能方法。SHINs對(duì)不同類型的乳腺組織最大增強(qiáng)的特征峰不同,可以用來(lái)區(qū)分乳腺IDC和正常乳腺組織。

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?吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院2012級(jí)

Biological characteristics of breast invasive ductal carcinoma detected by shell-isolated nanoparticleenhanced Raman spectroscopy and their clinical significances

ZHANG Hai-peng1,WU Di2,ZHANG Shi?,FU Tong2,LU Lu2,FAN Zhi-min2,ZHENG Chao2,HAN Bing2
(1.Department of Obstetrics Surgery,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China; 2.Department of Breast Surgery,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo identify normal breast tissue and breast invasive ductal carcinoma(IDC)tissue by shellisolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy(SHINERS),and to explore the biological characteristics of IDC and the identification method by discussing its spectroscopy characteristics.MethodsThe frozen section of breast tissue from 24 patients(female,aged 27－59 years)underwent routine surgical resection were obtained.9 cases of normal breast tissue and 15 cases of IDC breast tissue were detected by Raman spectroscopy and thenSHINERS technique was utilized.A total of 263 Raman spectra and 249 SHINERS spectra were obtained.All the spectra were dealt with baseline corrected by fitting and subtracting a third-order polynomial and then smoothed with a 15-point Adjacent-Averaging.ResultsThe characteristic peak of normal breast tissue appeared at 1 090,1 157, 1 262,1 300,1 442,1 658,1 745,and 1 874 cm－1.After adding shell-isolated nanoparticles(SHINs),some peaks shifted at 2－3 cm－1,and the relative strengthes of 1 090 and 1 157 cm－1were significantly increased,and the characteristic peak at 1 496 cm－1appeared.The Raman spectroscopy showed there were more nucleic acid characteristic peaks(including 878,1 086,1 157 cm－1)in the breast IDC tissue;after adding SHINs,the relative strengthes of 1 004,1 157,1 526,and 1 658 cm－1were increased,the characteristic peak of lipid at 1 745 cm－1and 1 442 cm－1stemmed from the C＝O and CH2 stretching vibration.Compared with the normal breast tissue, the breat IDC tissue showed a blue shift of 2－3 cm－1.The characteristic peaks of nucleic acid had the blue shift from 1 086 cm－1to 1 090 cm－1,and the characteristic peak ofβ-carotene emerged at 1 527 cm－1.ConclusionRaman spectra can discover the differences of the characteristic peaks of DNA,β-carotene,and protein between breast IDC and normal breast tissues;SHINERS can distinguish breast IDC tissue from normal breast tissue successfully.

breast neoplasms;Raman spectroscopy;surface enhanced Raman spectroscopy;invasive ductal carcinoma

R737.9

A

2014-02-10

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助課題(81202078);吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃青年基金資助課題(20130522030JH);吉林省科技廳科研基金資助課題(201015155)

張海鵬(1980－),女,吉林省長(zhǎng)春市人,主治醫(yī)師,在讀醫(yī)學(xué)博士,主要從事生物拉曼光譜的研究。

韓 冰(Tel:0431-81875672,E-mail:yintian77＠126.com);

付 彤(Tel:0431-88782963,E-mail:xxli＠jlu.edu.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-1064-05

10.13481/j.1671-587x.20140530