sirtinol對前列腺癌DU145細胞周期的影響及其機制

張大田,石建國,張 強,劉 巖

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院泌尿外科,遼寧錦州 121001)

sirtinol對前列腺癌DU145細胞周期的影響及其機制

張大田,石建國,張 強,劉 巖

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院泌尿外科,遼寧錦州 121001)

目的:觀察沉默信息調節(jié)因子1(SIRT1)抑制劑sirtinol對前列腺癌DU145細胞生長增殖、細胞周期進程和細胞周期正性調節(jié)蛋白Cyclin D1、CDK4及p Rb表達的影響,探討SIRT1在前列腺癌發(fā)生中的可能作用機制。方法:取處于對數生長期DU145細胞隨機分為對照組(DMSO組)和sirtinol組(終濃度分別為10、25和50μmol·L－1),MTT法測定各組DU145細胞生長抑制率,RT-PCR和Western blotting法檢測DU145細胞中SIRT1 m RNA和蛋白表達水平,流式細胞術檢測細胞周期進程,Western blotting法檢測DU145細胞中細胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4和p Rb的表達水平。結果:與對照組比較,各濃度sirtinol組DU145細胞生長抑制率明顯升高(P＜0.01),G1期細胞明顯增多(P＜0.01),且呈濃度依賴性。與對照組比較,各濃度sirtinol組DU145細胞中SIRT1 m RNA和蛋白表達水平明顯降低(P＜0.01),Cyclin D1和p Rb蛋白表達水平降低(P＜0.01),CDK4蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)。結論:下調SIRT1表達可以抑制前列腺癌DU145細胞的增殖和阻滯細胞周期進程,其機制可能與改變細胞周期蛋白CyclinD1和p Rb的表達有關。

sirtinol;沉默信息調節(jié)因子1;前列腺腫瘤;DU145細胞

隨著人口老齡化進程加快,我國前列腺癌發(fā)病率逐年增加,但前列腺癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制尚不清楚,年齡、種族、飲食和雄激素的分泌及代謝異常等均是腫瘤發(fā)生的危險因素。前列腺癌的發(fā)病與年齡有密切關聯,隨著人類預期生存年齡的增加,前列腺癌的發(fā)病率明顯增加[1-2],因此尋找新的分子生物學標記物和信號通路,明確前列腺癌的發(fā)生與年齡的關系,可為前列腺癌的診斷和治療提供新的理論基礎和實驗依據。沉默信息調節(jié)因子1 (silent information regulator 1,SIRT1)屬于sirtuin家族,與酵母SIR2高度同源,為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD＋)依賴性的組蛋白去乙?；?。SIRT1在DNA修復、細胞分化、炎癥和細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用[3-5]。有研究[6-8]顯示:腫瘤細胞中內源性SIRT1的表達高于正常細胞,推測SIRT1作為癌基因參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。而另一方面,最近有研究[9]報道:SIRT1在胃癌細胞中表達下調,并通過NF-κB/Cyclin D1信號通路導致細胞G1期阻滯,從而提示SIRT1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌作用。國內外對SIRT1在前列腺癌中的具體作用報道[10-11]也不一致。本研究選用不同濃度SIRT1抑制劑sirtinol作用于前列腺癌DU145細胞株,旨在探討下調SIRT1表達對人前列腺癌細胞株細胞周期阻滯和細胞周期蛋白表達的影響,初步闡明前列腺癌發(fā)生發(fā)展的可能機制, 為SIRT1作為前列腺癌的治療靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器sirtinol(S8825,HPLC≥98%,美國Sigma公司),DMEM培養(yǎng)液(美國Corning公司),SIRT1(鼠單克隆抗體,美國Merck Millipore公司),Cyclin D1(兔單克隆抗體,美國CST公司),CDK4(兔多克隆抗體,美國Abcam公司),p Rb抗體(山羊多克隆抗體)和β-actin抗體(兔多克隆抗體)(美國Santacruz公司),HRP標記的山羊抗兔、抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司),ECL化學發(fā)光試劑盒(美國Piece Biotechnology公司),MTT、Western blotting細胞裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京碧云天生物技術公司),RNA PCR Kit (AMV)Ver 3.0試劑盒(日本Takara公司)。BB16UV CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司),PCR擴增儀(美國Eppendorf公司),水浴式電轉印槽DYY-Ⅲ40B型(北京六一儀器廠),凝膠自動成像儀GDS8000和電泳儀(美國Bio-Rad公司), Sunrise自動酶標檢測儀(美國Tecan公司),流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組人前列腺癌DU145細胞購自上海生命科學院細胞和生物化學研究所,培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U·m L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,在飽和濕度、37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),當細胞匯合至培養(yǎng)瓶底面積約80%時以0.25%胰蛋白酶消化傳代。當細胞處于對數生長期時,以1×105m L－1濃度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶或96孔培養(yǎng)板中。24或48 h待細胞貼壁后給藥,sirtinol組終濃度分別為10、25和50μmol·L－1,對照組加入5μL DMSO(DMSO體積分數小于0.1%,該濃度對細胞生長無影響)。

1.3 MTT法檢測細胞生長抑制率取對數生長期DU145細胞,以1×105m L－1接種于96孔板上,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄上清液,分別加入不同濃度的sirtinol,各濃度組6個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24或48 h,加入20μL MTT(5 g·L－1)孵育4 h。棄去培養(yǎng)液,加入150μL二甲基亞砜,振蕩15 min,使沉淀物充分溶解。于酶標儀490 nm處測吸光度(A)值,計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率＝(1－加藥組A值/對照組A值)× 100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期進程將DU145細胞株接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,待細胞貼壁后加入不同濃度的sirtinol分別作用48 h,以胰酶-EDTA消化,采用5 m L培養(yǎng)液重懸細胞至單細胞懸液, 1 000 r·min－1離心5 min,用4℃預冷的PBS吹打成單細胞懸液,離心棄上清。加入5 m L冷PBS再離心1次,棄去上清。在避光條件下加入1 m L PI染液重懸細胞至單細胞懸液,室溫孵育30 min,采用流式細胞儀檢測,利用CellQuest分析軟件分析各組G1和S期DU145細胞所占百分率。

1.5 RT-PCR方法檢測SIRT1 m RNA表達水平采用Trizol一步法提取經不同濃度sirtinol處理48 h的DU145細胞總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,采用核酸蛋白測定儀測定RNA濃度,當A260/A280比值達1.9～2.0時可用于逆轉錄反應。用RNA PCR(AMV)Ver 3.0試劑盒,按說明書操作。反轉錄條件:42℃、30 min, 99℃、5 min,5℃、5 min。PCR引物序列: SIRT1,5′-TCAGTGTCATGGTTCCTTTGC-3′, 5′-AATCTGCTCCTTTGCCACTCT-3′,820 bp; GAPDH,5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′,5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′,306 bp;PCR反應條件:94℃預變性3 min;94℃、30 s,57℃、30 s,72℃、1 min, 30個循環(huán);72℃終延伸5 min。取PCR產物10μL進行瓊脂糖凝膠電泳并拍照,測量A值,m RNA表達水平以每一樣品A值與GAPDH A值比值表示。

1.6 Western blotting法檢測SIRT1、Cyclin D1、CDK4和p Rb的蛋白表達蛋白裂解液提取加藥處理48 h后的各組細胞總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度,－20℃或－80℃保存?zhèn)溆?。電泳?加入5×SDS樣品緩沖液,100℃煮沸5 min,離心后上樣,10%SDS-PAGE電泳分離,然后將蛋白轉至硝酸纖維素膜上,之后用含5%BSA的TBS (p H 7.4)將濾膜于室溫搖動溫育2 h進行封閉,封閉后的濾膜再分別與SIRT1(稀釋比1∶1 000), Cyclin D1、CDK4、p Rb抗體(稀釋比1∶200)及β-actin(稀釋比1∶1 000),4℃溫育過夜。經TTBS洗滌后,HRP偶聯的IgG作為二抗(稀釋比1∶5 000)室溫溫育2 h,洗膜后,采用ECL發(fā)光法顯色。采用Image J軟件分析密度,計算A值。蛋白表達水平以蛋白A值與β-actin A值比值表示。

1.7 統計學分析應用GraphPad Prism 5軟件進行統計學分析。各組細胞生長抑制率、G1和S期細胞百分率及m RNA和蛋白表達水平均以±s表示,兩兩比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 各組DU145細胞生長抑制率與對照組比較,各濃度(10、25和50μmol·L－1)sirtinol組DU145細胞生長抑制率明顯升高(P＜0.01),且隨sirtinol濃度的增加而升高,呈明顯的濃度-效應關系。見表1。

2.2 各組DU145細胞的細胞周期與對照組比較,不同濃度sirtinol組S期DU145細胞百分率降低(P＜0.01),隨著藥物濃度的增加,G1期細胞百分率升高(P＜0.01),且呈濃度效應關系。見表2。

表1 各組DU145細胞生長抑制率Tab.1 Inhibitory rates of growth of DU145 cells in various groups(n＝6,±s,η/%)

表1 各組DU145細胞生長抑制率Tab.1 Inhibitory rates of growth of DU145 cells in various groups(n＝6,±s,η/%)

?P＜0.01 compared with control group.

Group Inhiibitory rate of growth (t/h) 24 48 Control 4.62±1.21 4.83±1.24 Sirtinol(μmol·L－1) 10 12.61±2.52?14.70±2.71?25 20.64±3.63?22.93±3.98?50 41.51±5.76?49.33±5.86?

表2 各組DU145細胞各周期細胞百分率Tab.2 Percentages of DU145 cells at each cell cycle in various groups(n＝6,±s,η/%)

表2 各組DU145細胞各周期細胞百分率Tab.2 Percentages of DU145 cells at each cell cycle in various groups(n＝6,±s,η/%)

?P＜0.01 compared with control group.

Group Percentage of DU145 cells G1S Control 35.59±1.83 43.10±1.42 Sirtinol(μmol·L－1) 10 40.30±1.96?38.31±2.17?25 53.42±3.78?33.78±2.91?50 65.38±3.78?22.23±2.52?

2.3 各組DU145細胞中SIRT1 mRNA和蛋白表達水平與對照組比較,不同濃度sirtinol組DU145細胞SIRT1 m RNA和蛋白表達水平明顯降低(P＜0.01),且隨sirtinol濃度增加其表達水平逐漸降低。見表3。各組細胞中SIRT1 m RNA和蛋白表達電泳圖見圖1。

表3 各組DU145細胞中SIRT1 m RNA和蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of SIRT1 mRNA and protein in DU145 cells in various groups(n＝6,±s)

表3 各組DU145細胞中SIRT1 m RNA和蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of SIRT1 mRNA and protein in DU145 cells in various groups(n＝6,±s)

?P＜0.01 compared with control group.

Group SIRT1/GAPDH SIRT1/β-actin Control 0.028±0.006 0.085±0.009 Sirtinol(μmol·L－1) 10 0.019±0.005?0.073±0.007?25 0.017±0.006?0.038±0.005?50 0.008±0.003?0.012±0.005?

圖1 各組DU145細胞中SIRT1 m RNA(A)和蛋白(B)表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of SIRT1 mRNA (A)and protein(B)in DU145 cells in various groupsLane 1:Control group;Lane 2－4:10,25,and 50μmol·L－1sirtinol groups.

2.4 各組DU145細胞中Cyclin D1、CDK4和p Rb蛋白表達水平與對照組比較,不同濃度sirtinol組DU145細胞中Cyclin D1和p Rb蛋白表達水平明顯降低(P＜0.01),且隨sirtinol濃度增加其表達水平逐漸降低(P＜0.01),但CDK4蛋白表達水平無明顯變化(P＞0.05)。見圖2和表4。

表4 各組DU145細胞中Cyclin D1、CDK4和pRb蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of Cyclin D1,CDK4,and pRb proteins in DU145 cells in various groups(±s)

表4 各組DU145細胞中Cyclin D1、CDK4和pRb蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of Cyclin D1,CDK4,and pRb proteins in DU145 cells in various groups(±s)

?P＜0.01 compared with control group.

Group Cyclin D1/β-actin CDK4/β-actin p Rb/β-actin Control 1.191±0.023 0.371±0.021 1.082±0.072 Sirtinol(μmol·L－1) 10 0.053±0.011?0.375±0.033 0.022±0.008?25 0.040±0.009?0.367±0.018 0.018±0.006?50 0.023±0.007?0.379±0.041 0.013±0.005?

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段、多步驟和逐漸演變的過程,許多因素調控眾多的分子表達變化,形成了一個復雜的信號通路。有研究[5]表明: SIRT1在這一進程中扮演了重要角色。為了研究SIRT1在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用,本文作者首先使用不同濃度的SIRT1抑制劑sirtinol分別作用于前列腺癌DU145細胞24和48 h,MTT測定結果表明:sirtinol(10～50μmol·L－1)能抑制DU145細胞的增生,并且具有濃度和時間依賴性,說明sirtinol具有抑制細胞增殖作用,與Lee等[12]的報道結果一致。同時本研究結果顯示:不同濃度sirtinol處理DU145細胞后,隨著sirtinol濃度的增加,SIRT1 m RNA和蛋白表達水平逐漸降低,說明sirtinol可以改變內源性SIRT1的表達和活性。細胞周期進展是反映細胞增殖速度的一個重要指標。為了研究內源性SIRT1對細胞周期的影響,本文作者利用不同濃度sirtinol處理DU145細胞48 h后改變細胞內源性SIRT1的活性,并利用流式細胞術分析細胞周期,結果表明:與對照組比較,sirtinol處理后G1期細胞百分率增加,細胞周期阻滯在G1期。為了探討SIRT1影響細胞周期進展可能的分子機制,本文作者檢測了細胞周期正性關鍵調控分子Cyclin D1、CDK4和p Rb的表達變化。細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)是調控細胞進展的2類關鍵分子[13], Cyclin D1是第一個被發(fā)現的細胞周期調控分子,在外界信號刺激下,Cyclin D1與CDK4結合形成具有活性的異源二聚體,使視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma,Rb)磷酸化而失活,推動細胞周期由G1期向S期進展[14-15]。Western blotting法檢測結果提示:下調SIRT1表達可以抑制Cyclin D1和p Rb表達,但不引起CDK4的表達變化。

綜上所述,本研究證實下調SIRT1表達和活性可以抑制前列腺癌細胞的體外增殖和阻滯細胞周期進程,其機制可能與改變細胞周期蛋白Cyclin D1和p Rb的表達有關。本研究結果提示SIRT1在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演癌基因的角色。有關SIRT1在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的分子途徑及信號通路尚需深入研究。

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Influence of sirtinol in cell cycle of prostate cancer DU145 cells and its mechanism

ZHANG Da-tian,SHI Jian-guo,ZHANG Qiang,LIU Yan
(Department of Urinary Surgery,First Affiliated Hospital,Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China)

ObjectiveTo observe the influence of sirtinol,a silent information regulator 1(SIRT1)inhibitor,in the cell proliferation,cell cycle progression and the expression levels of positive regulator proteins of the cell cycle including Cyclin D1,CDK4 and pRb in prostate cancer DU145 cells,and to explore the possible mechanism of SIRT1 in occurrence of prostagte cancer.MethodsThe DU145 cells at logarithmic growth phase were cultured in vitro and divided into control group(DMSO)and different doses(10,25,50μmol·L－1)of sirtinol groups.The inhibitory rate of growth of DU145 cells was detected with MTT method,the SIRT1 m RNA and protein expression levels were determined by RT-PCR and Western blotting method,and the cell cycle was measured by flow cytometry.The Cyclin D1,CDK4 and p Rb protein expression levels were examined by Western blotting method.ResultsCompared with control group,the inhibitory rates of growth of the DU145 cells in different doses of sirtinol groups were increased markedly in a dose-dependent manner(P＜0.01),and the flow cytometry analysis result showed the DU145 cells at G1phase were increased(P＜0.01).Compared with control group,the expression levels of SIRT1 mRNA and protein in DU145 cells in different doses of sirtinol groups were decreased significantly (P＜0.01);the expression levels of Cyclin D1 and p Rb proteins were decreased(P＜0.01),whereas the expression levels of CDK4 had no change(P＞0.05).ConclusionSIRT1 inhibition by sirtinol can inhibit the cellgrowth of prostate cancer DU145 cells in a dose-dependent manner and arrest the cell cycle progression,and its mechanism may be related to decreasing the CyclinD1 and p Rb protein expressions.

sirtinol;silent information regulator 1;prostate neoplasms;DU145 cells

R737.25

A

2014-02-14

遼寧省科技廳科學計劃項目資助課題(2011225015)

張大田(1969－),男,吉林省通化市人,副主任醫(yī)師,醫(yī)學碩士,主要從事泌尿系統腫瘤的生物學研究。

劉 巖(Tel:0416-419763,E-mail:liuyanforest＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0967-05

10.13481/j.1671-587x.20140512