DAB2IP基因慢病毒載體構(gòu)建及其在前列腺癌PC3細胞中的表達

華 興,潘文海

(1.暨南大學第四附屬醫(yī)院廣州市紅十字會醫(yī)院病理科,廣東廣州 510515;2.暨南大學第四附屬醫(yī)院廣州市紅十字會醫(yī)院泌尿外科,廣東廣州 510515)

DAB2IP基因慢病毒載體構(gòu)建及其在前列腺癌PC3細胞中的表達

華 興1,潘文海2

(1.暨南大學第四附屬醫(yī)院廣州市紅十字會醫(yī)院病理科,廣東廣州 510515;2.暨南大學第四附屬醫(yī)院廣州市紅十字會醫(yī)院泌尿外科,廣東廣州 510515)

目的:構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒pSin-EF2-Puro-DAB2IP并轉(zhuǎn)染前列腺癌PC3細胞,觀察其轉(zhuǎn)染效率及其在PC3細胞中的表達。方法:以人前列腺癌PC3細胞基因組cDNA為模板PCR擴增獲得目的基因DAB2IP片段后,應(yīng)用基因重組技術(shù)將目的片段克隆到PC3-pSin慢病毒表達載體,經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定后,重組慢病毒表達質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞,獲得攜帶DAB2IP基因的重組慢病毒。取病毒上清感染人前列腺癌PC3細胞,以PC3-pSin-EF2為對照,分別采用RT-QPCR、Western blotting法檢測DAB2IP在靶細胞中的表達水平。結(jié)果:重組慢病毒質(zhì)粒pSin-EF2-Puro-DAB2IP經(jīng)PCR、EcoRⅠ和NheⅠ雙酶切鑒定結(jié)果與目的基因條帶吻合,克隆測序結(jié)果與NCBI收錄的DAB2IP基因序列(NM_138709)完全一致。重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細胞收獲慢病毒上清可高效感染PC3細胞,對照組細胞株P(guān)C3-pSin-EF2及過表達細胞株P(guān)C3-pSin-EF2-DAB2IP 內(nèi)DAB2IP基因的相對拷貝數(shù)分別為0.001±0.000和0.158±0.013,與對照組細胞比較,過表達細胞內(nèi)DAB2IP基因mRNA表達水平上調(diào)(179.37±15.89)倍,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);Western blotting法,對照組PC3-pSin-EF2細胞中DAB2IP蛋白表達水平為內(nèi)參的(1.002±0.783)倍,PC3-pSin-EF2-DAB2IP細胞組為內(nèi)參的(2.431±0.892)倍,過表達組DAB2IP蛋白表達水平為對照組的(2.415±0.961)倍,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結(jié)論:成功構(gòu)建攜帶DAB2IP基因的慢病毒表達載體pSin-EF2-Puro-DAB2IP,并使目的基因在靶細胞中穩(wěn)定表達,為進一步研究DAB2IP基因的相關(guān)功能提供了優(yōu)質(zhì)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體。

DAB2IP;慢病毒載體;前列腺腫瘤

前列腺癌是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其發(fā)生發(fā)展涉及到一系列癌基因及抑癌基因的改變[1]。DAB2IP(DOC2/DAB2 interaction protein)基因是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,參與細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),影響細胞的生長發(fā)育和凋亡[2-3]。近來研究[4-5]發(fā)現(xiàn):DAB2IP在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中表達下調(diào),因而引起人們的關(guān)注。但DAB2IP在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體功能及作用機制尚不清楚。本研究構(gòu)建攜帶DAB2IP基因的重組慢病毒載體,感染人前列腺癌PC3細胞,并使DAB2IP基因在靶細胞中穩(wěn)定表達,旨在為進一步研究DAB2IP基因的相關(guān)功能提供優(yōu)質(zhì)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑人前列腺癌PC3細胞購自中山大學醫(yī)學實驗中心,293FT細胞購自美國Invitrogen公司,均為貼壁細胞;DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技有限公司;cDNA表達載體pSin-EF2及包裝載體pSPAX、p MD2G購自美國Promega公司,Eco RⅠ、NheⅠ內(nèi)切酶、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、質(zhì)粒大提取試劑盒、膠回收試劑盒、Taq酶和DNA相對分子質(zhì)量標準均購自日本Takara公司,LipofectamineTM2000、Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司,0.45μm PVDF膜為美國Millipore公司產(chǎn)品,DAB2IP多克隆抗體、β-actin單克隆抗體均購自英國Abcom公司,其他常規(guī)化學試劑購于廣州威佳科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計與合成根據(jù)NCBI DAB2IP基因序列(NCBI登錄號為NM_138709)全長設(shè)計合成引物:DAB2IP-F,5′-CCGGAATTCATGCCGAGGCTGAAGGAGTC-3′(Eco RⅠ);DAB2IP-R, 5′-CTAGCTAGCTTAACAATTGCTGCTGTTTCTGAACT-3′(NheⅠ),上、下游引物5′端加上Eco RⅠ和NheⅠ2個酶切位點及保護堿基,引物經(jīng)BLAST軟件特異性分析,由美國Invitroigen公司合成。

1.3 重組慢病毒表達載體pSin-EF2-Puro-DAB2IP的構(gòu)建以PC3細胞基因組cDNA為模板,進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)完畢后行0.8%低熔點瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收DAB2IP目的片段,用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和NheⅠ分別雙酶切,切膠回收目的片段和提取pSin-EF2質(zhì)粒,回收酶切產(chǎn)物,將純化后的雙酶切產(chǎn)物采用Takara的快速連接酶, 16℃連接30 min,連接后命名為pSin-EF2-Puro-DAB2IP。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,隨機挑取數(shù)個中等偏小偏圓的白色單克隆菌落,分別搖菌過夜,經(jīng)PCR和酶切鑒定,陽性克隆送華大基因公司進行測序。

1.4 慢病毒包裝制備培養(yǎng)293FT細胞,并于轉(zhuǎn)染前1 d接種到直徑10 cm培養(yǎng)皿,當細胞長至80%飽和度時,將慢病毒表達載體pSin-EF2或pSin-EF2-Puro-DAB2IP分別與輔助質(zhì)粒pSPAX 和p MD2G混合后,加入30μL Lipofectamine 2000陽離子脂質(zhì)體,共轉(zhuǎn)染293FT包裝細胞,轉(zhuǎn)染10 h后,更換完全培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM),并在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,收集上清液,3 000 r·min－1離心5 min,經(jīng)0.45μm PVDF膜過濾,分裝后凍存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 慢病毒感染人前列腺癌細胞PC3轉(zhuǎn)染前1 d 將PC3細胞接種至24孔板中,每孔2×105個細胞,使培養(yǎng)細胞達到80%～85%匯合。去除孔內(nèi)的培養(yǎng)基,將含病毒的完全培養(yǎng)基加入細胞培養(yǎng)孔中,病毒感染的同時加入工作液濃度為5 g·L－1的聚凝胺(polybrene)以增加感染效率,每12 h重復(fù)感染1次,共感染3次,感染完畢后換為1 m L的完全培養(yǎng)基過夜;之后加入嘌呤霉素(pruomyein,Puro)(0.5 mg·L－1)抗性篩選獲得PC3-psin-EF2和PC3-psin-EF2-DAB2IP穩(wěn)定株細胞。

1.6 感染后鑒定維持抗性濃度的Puro培養(yǎng)液擴增穩(wěn)定感染的PC3-pSin-EF2和PC3-pSin-EF2-DAB2IP細胞,以每孔5×105個細胞接種于6孔板,24 h后收集穩(wěn)定細胞株的RNA及蛋白質(zhì),進行RT-QPCR及Western blotting法檢測。

1.7 RT-QPCR檢測DAB2IP m RNA表達水平每孔加入1 m L Trizol提取細胞總RNA,采用核酸分光光度儀定量及測定其純度,應(yīng)用MMLVRT逆轉(zhuǎn)錄酶合成c DNA,使用普通PCR反應(yīng)進行條件探索及優(yōu)化,SYBR Premix Ex Taq Kit進行QPCR檢測DAB2IP m RNA表達情況。其中β-actin作為內(nèi)參,所需引物序列如下:DAB2IP-F, 5′-AGCTGGAGCAGAGCAT AGTA-3′,DAB2IP-R, 5′-GGTGTGGAGGCCAGGTCATT-3′,擴增產(chǎn)物124 bp;β-actin-F,5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′,β-actin-R,5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′,擴增產(chǎn)物186 bp(下劃線為酶切位點)。檢測指標:目的基因m RNA相對拷貝數(shù)(DAB2IP基因與內(nèi)參基因的表達差異倍數(shù))及實驗組與對照組DAB2IP的表達差異倍數(shù)。

1.8 Western blotting法檢測DAB2IP蛋白表達水平收集PC3-pSin-EF2和PC3-pSin-EF2-DAB2IP細胞,采用1 m L預(yù)冷PBS洗滌2次,加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min。槍頭吹打以充分裂解細胞后提取總蛋白,經(jīng)BCA法檢測蛋白濃度后行12%SDS-PAGE電泳分離,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上, 將PVDF膜浸入5%脫脂奶粉/TBST,室溫搖床緩慢搖動,封閉60 min,DAB2IP一抗4℃孵育過夜(1∶3 000稀釋)、β-actin二抗37℃孵育1 h (1∶6 000稀釋),加入凱基超敏型ECL檢測液進行發(fā)光,在暗室中行壓片、顯影和定影。結(jié)果以培清凝膠成像分析系統(tǒng)拍照,條帶灰度分析軟件Image J分析DAB2IP蛋白的表達水平(目標蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度的比值。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。DAB2IP m RNA和蛋白相對表達水平以±s表示,組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 目的片段獲得以PC3細胞基因組cDNA為模板PCR獲得目的基因DNA后,進行瓊脂糖凝膠電泳,可見3 216 bp明亮特異的目的條帶(圖1),大小與理論值一致。

2.2 重組慢病毒表達載體pSin-EF2-Puro-DAB2IP的鑒定目的基因片段經(jīng)膠回收連接于pSin-EF2慢病毒載體,挑取菌落PCR鑒定陽性的單克隆進行培養(yǎng),重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和NheⅠ進行雙酶切后,獲得約7 500和3 216 bp的條帶(圖2),與理論值大小一致,表明DAB2IP插入pSin-EF2載體中。將鑒定出的陽性克隆送于華大基因公司進行測序,測序結(jié)果與GenBank中DAB2IP基因(NCBI,NM_138709)標準序列一致(圖3),說明重組慢病毒質(zhì)粒pSin-EF2-Puro-DAB2IP構(gòu)建成功。

圖1 PCR擴增目的基因DAB2IP的電泳圖Fig.1 Electrophoregram of DAB2IP gene amplified by PCRM:Marker DL 5000;Lane 1:DAB2IP.

圖2 重組質(zhì)粒經(jīng)Eco RⅠ和NheⅠ雙酶切鑒定的電泳圖Fig.2 Electrophoregram of identification of recombinant plasmid digested by Eco RⅠand NheⅠM:Marker DL 5000;Lane 1－3:Positive clones.

圖3 經(jīng)酶切鑒定陽性克隆菌液測序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of positive clones identified by enzyme digestion liquid

2.3 RT-QPCR檢測DAB2IP mRNA表達慢病毒感染PC3細胞后加入Puro(0.5 mg·L－1)抗性篩選獲得PC3-pSin-EF2和PC3-pSin-EF2-DAB2IP穩(wěn)定株細胞。提取RNA后行RT-QPCR檢測DAB2IP m RNA表達情況。與對照組細胞PC3-pSin-EF2比較,PC3-pSin-EF2-DAB2IP組細胞內(nèi)DAB2IP基因表達水平上調(diào)(179.37± 15.89)倍(P＜0.001)。見表1。

表1 RT-QPCR檢測慢病毒感染PC3細胞后DAB2IP m RNA表達水平Tab.1 Expression levels of DAB2IP mRNA in PC3 cells after infected with lentivirus detected by RT-PCR

2.4 Western blotting法檢測DAB2IP蛋白表達收集PC3-pSin-EF2和PC3-pSin-EF2-DAB2IP細胞裂解液作為樣本,Western blotting法檢測DAB2IP蛋白表達情況。DAB2IP蛋白相對分子質(zhì)量為118 000(圖2),經(jīng)條帶灰度分析軟件測量顯示:對照組PC3-pSin-EF2細胞DAB2IP蛋白表達水平為內(nèi)參的(1.002±0.783)倍,PC3-pSin-EF2-DAB2IP細胞組為內(nèi)參的(2.431± 0.892)倍,PC3-pSin-EF2-DAB2IP組DAB2IP蛋白表達水平為對照組的(2.415±0.961)倍,后2組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),提示成功建立DAB2IP穩(wěn)定過表達細胞株。

圖4 Western blotting法檢測慢病毒感染PC3細胞后DAB2IP蛋白表達電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expression of DAB2IP protein in PC3 cells after infected with lentivirus detected by Western blotting methodLane 1:Vector;Lane 2:DAB2IP.

3 討論

細胞基因轉(zhuǎn)染有多種載體可供選擇,如質(zhì)粒、脂質(zhì)體、反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒等,其中慢病毒載體作為一類來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體,以其轉(zhuǎn)染效率高、可感染分裂期和非分裂期細胞、容納外源性基因片段大等優(yōu)點,在科研領(lǐng)域有著良好的發(fā)展前景[6-7]。慢病毒載體不僅能將目的基因整合到宿主細胞染色體中,長期穩(wěn)定表達外源基因,還可為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液,產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物,慢病毒載體是目前理想的基因治療載體系統(tǒng)[8-9]。

DAB2IP是Ras GTPase-activating protein (Ras GAP)家族的新成員,其與DAB2/DOC2蛋白的N末端結(jié)合,是DAB2信號途徑的下游效應(yīng)器;而DAB2是重要的腫瘤抑制基因,在多種腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用[10-11]。DAB2IP作為一種新的GTPase激活蛋白,是Ras和腫瘤壞死因子介導(dǎo)的凋亡通路等多條信號通路中的重要環(huán)節(jié),廣泛參與細胞內(nèi)多條信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),如MAPK/ERK、ASK1-JNK、PI3K-AKT和NF-κB信號通路等,其能結(jié)合到腫瘤抑制蛋白DOC2/DAB2的N端,介導(dǎo)DAB2信號通路的下游效應(yīng),從而發(fā)揮其腫瘤抑制作用[3,12-13]。

DAB2IP表達下調(diào)和抑癌功能喪失與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),如前列腺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌和肺癌等[13-14]。Chen等[15]發(fā)現(xiàn):人正常前列腺上皮細胞有DAB2IP基因表達,而在前列腺癌細胞DAB2IP基因表達缺失或下調(diào)。研究[16]顯示:在前列腺癌組織中DAB2IP啟動子區(qū)域高甲基化,該區(qū)域及附近區(qū)域Cp G島胞嘧啶的甲基化可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達,引起相應(yīng)的基因沉默,而去甲基化處理后又可使其恢復(fù)表達。

DAB2IP作為重要的抑癌基因,對該基因的進一步研究將為腫瘤的診斷和治療提供新途徑,有望成為治療腫瘤的突破口之一。本實驗成功構(gòu)建攜帶DAB2IP基因的慢病毒表達載體pSin-EF2-Puro-DAB2IP,并使DAB2IP基因在前列腺癌PC3細胞中穩(wěn)定表達,為進一步研究DAB2IP基因的相關(guān)功能提供了優(yōu)質(zhì)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體。

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Construction of lentiviral vector of DAB2IP gene and its expression in prostate carcinoma PC3 cells

HUA Xing1,PAN Wen-hai2
(1.Department of Pathology,Forth Affiliated Hospital,Jinan University,Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510515,China;2.Department of Urinary Surgery,Forth Affiliated Hospital, Jinan University,Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510515,China)

ObjectiveTo construct recombinant lentiviral vector pSin-EF2-Puro-DAB2IP transfect prostate carcinoma PC3 cells,and to observe its transfection rate and expression level in PC3 cells.MethodsThe cDNA sequences specifically targeting the DAB2IP gene were designed and cloned into lentiviral vector PC3-pSin usingDNA recombinant technique.Using PC3-pSin-EF2 as control,the 293T cells were transfected by Lipofectamine reagent for lentiviral particles packaged,and viral titer was determined.The DAB2IP mRNA and protein expression levels were examined by RT-PCR and Western blotting methods.ResultsThe PCR and sequencing analysis results confirmed that the DAB2IP gene sequence was consistent with the sequence in GeneBank.The number of DAB2IP gene copy in PC3-pSin-EF2-DAB2IP cells and its control PC3-pSin-EF2 cells were 0.001±0.000 and 0.158±0.013,respectively.Compared with control cells,the overexpression of m RNA in PC3-pSin-EF2-DAB2IP cells upregulated(179.370±15.891)times,the difference was statistically significant(P＜0.001). Compared with internal reference and control cells,the expression levels of DAB2IP protein in PC3-pSin-EF2-DAB2IP cells upregulated(2.431±0.892)times and(2.415±0.961)times respectively,the differences were statistically significant(P＜0.001).ConclusionThe lentiviral vector of the DAB2IP gene pSin-EF2-Puro-DAB2IP is successfully constructed,and its targeted gene is stably expressed in the targeted cells,which provides a basis for the further functional study of DAB2IP.

DAB2IP;lentiviral vector;prostate neoplasms

R737.25

A

2014-01-24

國家自然科學基金面上項目資助課題(81272849);廣東省科技廳科技計劃項目資助課題(2011B061200021)

華 興(1975－),男,安徽省安慶市人,副主任醫(yī)師,醫(yī)學博士,主要從事泌尿男科基礎(chǔ)和臨床病理研究。

潘文海(Tel:020-34403830,E-mail:pwh189＠189.cn)

時間: 2014-08-27 14:38

網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.R.20140827.1438.001.html

1671-587Ⅹ(2014)05-0938-05

10.13481/j.1671-587x.20140506