電離輻射對轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Egr-1-AIF△1-480質(zhì)粒的MCF-7細胞增殖和侵襲能力的影響

齊亞莉,劉洪彬,謝忠偉,劉彥軍,王劍鋒

(1.北華大學公共衛(wèi)生學院流行病學教研室,吉林吉林 132011;2.吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生部放射生物學重點實驗室,吉林長春 130021;3.吉林省吉林(市)出入境檢驗檢疫局,吉林吉林 132013; 4.吉林省長春市人民醫(yī)院放療科,吉林長春 130051;5.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院放療科,吉林長春 130033)

電離輻射對轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Egr-1-AIF△1-480質(zhì)粒的MCF-7細胞增殖和侵襲能力的影響

齊亞莉1,2,劉洪彬3,謝忠偉3,劉彥軍4,王劍鋒2,5

(1.北華大學公共衛(wèi)生學院流行病學教研室,吉林吉林 132011;2.吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生部放射生物學重點實驗室,吉林長春 130021;3.吉林省吉林(市)出入境檢驗檢疫局,吉林吉林 132013; 4.吉林省長春市人民醫(yī)院放療科,吉林長春 130051;5.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院放療科,吉林長春 130033)

目的:探討輻射增強靶向截短型凋亡誘導因子(AIFΔ1-480)對MCF-7細胞增殖和侵襲能力的影響,闡明其提高腫瘤基因-放射治療的可能性。方法:人乳腺癌MCF-7細胞經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染早期生長反應1(Egr-1)介導的AIFΔ1-480重組表達載體pcDNA3.1-Egr-1-AIFΔ1-480(p E-AIFΔ1-480),2 Gy X射線照射后24 h,分別采用MTT法和Transwell侵襲實驗檢測細胞增殖和侵襲能力。實驗分為正常對照組、pcDNA3.1組(只轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒)、p E-AIFΔ1-480組(轉(zhuǎn)染p E-AIFΔ1-480質(zhì)粒)、2 Gy X線照射組和p E-AIFΔ1-480＋2 Gy X線照射組。結果:質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并經(jīng)2 Gy X線照射后,正常對照組、pcDNA3.1組和p E-AIFΔ1-480質(zhì)粒組細胞生長較快,且增殖規(guī)律基本一致。與正常對照組比較,2 Gy X線照射組和pE-AIFΔ1-480＋2 Gy X線照射組細胞增殖能力顯著降低(P＜0.05),且以p E-AIFΔ1-480＋2 Gy X線照射組降低更明顯,從12 h開始較2 Gy X線照射組明顯降低(P＜0.05)。正常對照組、pcDNA3.1組和p E-AIFΔ1-480組穿過基底膜細胞數(shù)基本一致,而2 Gy X線照射組和p E-AIFΔ1-480＋2 Gy照射組穿過基底膜細胞較正常對照組明顯減少(P＜0.05或P＜0.01),并且p E-AIFΔ1-480＋2 Gy照射組穿過基底膜的細胞數(shù)較2 Gy照射組減少更明顯(P＜0.01)。結論:AIFΔ1-480和電離輻射均能抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖和侵襲,二者具有協(xié)同作用,并且Egr-1啟動子能增強輻射條件下的抑制效果。

早期生長反應1;截短型凋亡誘導因子;細胞增殖;侵襲;電離輻射

自從Kufe等[1]和Weichselbaum等[2]提出以輻射敏感早期生長反應1(early growth response 1, Egr-1)基因啟動子介導目的基因,進而對腫瘤細胞起到殺傷作用以來,腫瘤基因-放射治療取得了長足進步。該理念是將輻射誘導性的調(diào)控序列與腫瘤殺傷基因相偶聯(lián)后,再給予腫瘤局部放療以誘導腫瘤殺傷基因表達,使輻射與殺傷基因表達產(chǎn)物協(xié)同抑瘤,同時也利用輻射的定位作用和可操控性,實現(xiàn)了對殺傷基因表達的時空調(diào)控[3-4]。腫瘤殺傷基因包括癌基因、抑癌基因和凋亡誘導基因等,如何選擇非常關鍵。凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor,AIF)是1996年發(fā)現(xiàn)的一種線粒體相關分子,其478～610位置氨基酸為C末端,具有凋亡誘導活性[5]。已有研究[5-6]表明:截短型AIF因為存在C末端,仍保留促凋亡活性,并且其編碼480～613氨基酸的蛋白質(zhì)具有相對分子質(zhì)量小和更利于應用于臨床的特點。本實驗構建正確的含Egr-1的人截短型AIFΔ1-480重組表達載體并轉(zhuǎn)染MCF-7細胞,聯(lián)合X線照射,觀察細胞增殖和侵襲的變化,為腫瘤基因-放射治療提供新的理論基礎和實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人乳腺癌MCF-7細胞株和NIH/3T3細胞由吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生部放射生物學重點實驗室保存。胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基和RPMI 1640(Gibco公司,美國), LipofectamineTM2000(Invitrogen公司,美國),噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT;Sigma公司,美國),吉姆薩染液(Applichem公司,德國),其他生化試劑為國產(chǎn)分析純。低溫高速離心機(Tomy公司,日本),Transwell小室(Pierce公司,美國),酶標儀(Bio-Rad公司,美國), X.S.S.205(FZ)型深部X線治療機(國產(chǎn))。

1.2 pc DNA3.1-Egr-1-AIFΔ1-480轉(zhuǎn)染和X線照射pcDNA3.1-Egr1-AIFΔ1-480質(zhì)粒已構建完成,并且AIFΔ1-480蛋白具有一定的輻射誘導表達規(guī)律[7]。質(zhì)粒大量提取后,使用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000作為轉(zhuǎn)染試劑進行瞬時轉(zhuǎn)染,詳細步驟按照說明書操作。按1×105m L－1接種于24孔細胞培養(yǎng)板中。24 h后當細胞密度達到80%～90%融合時進行轉(zhuǎn)染,質(zhì)粒與脂質(zhì)體均采用無血清、無抗生素DMEM稀釋,終濃度分別為1.0和2.5 g·50 L－1,質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例為1∶2.5進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育,6 h后換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),并進行2 Gy X線照射,照射條件為靶皮距50 cm,濾板0.5 mm Cu和1.0 mm Al,劑量率0.287 Gy·min－1。

1.3 實驗分組MCF-7細胞分為正常對照組、pcDNA3.1組(只轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒)、p E-AIFΔ1-480組(轉(zhuǎn)染p E-AIFΔ1-480質(zhì)粒)、2 Gy X線照射組和p E-AIFΔ1-480＋2 Gy X線照射組。

1.4 MTT法檢測細胞增殖能力各組MCF-7細胞按照6×104m L－1接種于96孔板,每孔100μL,每塊板設為1個時間點,共5個時間點。24 h后用脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后進行2 Gy X線照射,分別于照射后0、4、12、24和48 h取出一塊板,加入濃度為5 g·L－1的MTT溶液10μL,置于CO2孵箱中繼續(xù)孵育4 h;終止培養(yǎng)后,除去孔內(nèi)上清液,向每孔內(nèi)加入100μL DMSO,振蕩處理,保證結晶充分溶解;在酶標儀上于490 nm波長測定各孔吸光度(A490)值,以此表示細胞增殖能力[8-9], A值越大,細胞增殖能力越強。各組設6復孔。

1.5 細胞侵襲能力檢測①條件培養(yǎng)液的制備: NIH/3T3細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,待細胞達到80%～90%融合時,用無血清的培養(yǎng)基洗3次。加入新鮮無血清培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)36～48 h。用0.22μm孔徑的濾器過濾收集到的培養(yǎng)基上清液,即得到含趨化因子的條件培養(yǎng)基,凍存于－70℃中備用。②Transwell侵襲實驗:按照Matrigel膠∶無血清培養(yǎng)基＝1∶3的比例稀釋并混勻,Transwell小室的上室聚碳酸酯膜上加入80μL Matrigel膠稀釋液,于37℃條件下聚合30 min。將接種于6孔板的人乳腺癌MCF-7細胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染換液,2 Gy X線照射24 h后,采用0.25%胰酶消化,PBS漂洗,使用臺盼藍染色并計數(shù)活細胞數(shù),無血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至1.0×106m L－1。將NIH/3T3條件培養(yǎng)液加入24孔板內(nèi),每孔200μL,將制備好的Transwell小室置入孔中,上室可加入100μL細胞懸液,使細胞數(shù)達到1.0×105個/孔,置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)18 h。去除上室中的培養(yǎng)液,并用棉簽蘸生理鹽水輕輕擦去Matrigel膠,采用0.1%結晶紫染色后,使用倒置顯微鏡觀察,于400倍視野下任取5個不重復視野照相,并記錄穿膜細胞數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計學處理。各組細胞A490值及穿膜細胞數(shù)以±s表示,兩兩比較采用Student’s t檢驗。

2 結果

2.1 各組人乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力正常對照組、pcDNA3.1組和p E-AIFΔ1-480組細胞生長較快,其中12、24和48 h與0 h比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),并且增殖規(guī)律基本一致。而2 Gy照射組和p E-AIFΔ1-480＋2 Gy照射組細胞增殖受抑,且以p E-AIFΔ1-480＋2 Gy組受抑更明顯。從12 h開始,p E-AIFΔ1-480＋2 Gy照射組較2 Gy照射組細胞增殖能力顯著降低(P＜0.05)。見表1。

表1 各組MCF-7細胞轉(zhuǎn)染和照射后的A490值Tab.1 A490values of MCF-7 cells after transfection and irradiation in various groups(n＝6,±s)

表1 各組MCF-7細胞轉(zhuǎn)染和照射后的A490值Tab.1 A490values of MCF-7 cells after transfection and irradiation in various groups(n＝6,±s)

?P＜0.05 vs 0 h;△P＜0.05 vs normal control group;＃P＜0.05 vs 2 Gy group.

Group A490value (t/h) 0 4 12 24 48 Normal control 0.77±0.06 0.82±0.03 0.99±0.04?1.17±0.08?1.41±0.07?pcDNA3.1 0.73±0.10 0.76±0.05 0.98±0.02?1.07±0.07?1.28±0.05?pE-AIFΔ1-4800.71±0.03 0.75±0.07 0.94±0.04?1.09±0.03?1.31±0.06?2 Gy 0.69±0.02△0.68±0.01?△0.75±0.01?△0.81±0.04?△0.84±0.03?△p E-AIFΔ1-480＋2 Gy 0.66±0.02△0.65±0.03△0.66±0.01△＃0.67±0.02△＃0.66±0.04△＃

2.2 各組人乳腺癌MCF-7細胞的侵襲能力正常對照組、pcDNA3.1組和pcDNA3.1-Egr-1-AIFΔ1-480組穿過基底膜細胞數(shù)基本一致,而2 Gy照射組和pc DNA3.1-Egr-1-AIFΔ1-480＋2 Gy照射組穿過基底膜細胞較正常對照組明顯減少(P＜0.05或P＜0.01);并且pcDNA3.1-Egr-1-AIFΔ1-480＋2 Gy照射組穿過基底膜細胞數(shù)較2 Gy照射組減少更顯著(P＜0.01)。見表2和圖1(插頁一)。vs 2 Gy group.

表2 各組MCF-7細胞的侵襲能力Tab.2 Invasion abilities of MCF-7 cells in virous groups (n＝3,±s)

表2 各組MCF-7細胞的侵襲能力Tab.2 Invasion abilities of MCF-7 cells in virous groups (n＝3,±s)

?P＜0.05,??P＜0.01 vs normal control group;△P＜0.01

Group Number of cell permeating membrane/sight Normal control 51.0±3.11 pcDNA3.1 51.0±3.52 p E-AIFΔ1-48047.0±2.26 2 Gy 42.3±1.63?p E-AIFΔ1-480＋2 Gy 22.7±2.05??△

3 討 論

腫瘤細胞增殖能力較強,侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤細胞的重要特性,利用這2個指標可以判定腫瘤細胞被殺傷效果。本實驗采用MTT法和Transwell小室檢測乳腺癌細胞增殖能力和侵襲能力結果顯示:正常對照組、pcDNA3.1組和p E-AIFΔ1-480組細胞增殖和穿膜能力基本一致,這說明無電離輻射的條件下,Egr-1啟動子無明顯效應;2 Gy照射組和pE-AIFΔ1-480＋2 Gy照射組細胞增殖能力和穿膜能力均顯著降低,并且以p E-AIFΔ1-480＋2 Gy照射組降低更明顯,這說明單純轉(zhuǎn)染p E-AIFΔ1-480質(zhì)粒并不能誘導蛋白表達,不能導致細胞增殖能力和穿膜細胞數(shù)降低,而聯(lián)合2 Gy照射后則能夠增強照射導致的細胞增殖抑制和細胞穿膜能力的降低,細胞基本處于停止狀態(tài),細胞穿過基底膜數(shù)量減少更明顯。上述結果表明:截短型AIFΔ1-480的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲,電離輻射也可以抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲,當截短型AIFΔ1-480與輻射聯(lián)合應用時,能發(fā)揮協(xié)同作用,對腫瘤細胞增殖和侵襲的抑制更加明顯,且輻射可以誘導Egr-1啟動子激活并增強截短型AIFΔ1-480的表達,從而達到最佳的抑制效果。

本研究結果與腫瘤基因-放射治療的理念非常吻合,既發(fā)揮基因治療的作用,又發(fā)揮電離輻射的作用,二者協(xié)同,使治療效果最優(yōu)化。腫瘤基因-放射治療是同時將具有輻射誘導特性和腫瘤殺傷的基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞,一方面通過放療殺傷腫瘤細胞,另一方面通過輻射作用誘導腫瘤殺傷基因表達,產(chǎn)生電離輻射和基因?qū)δ[瘤細胞的協(xié)同作用[10-11]。自從Weichselbaum等[2-3]提出這一理念以來,關于Egr-1基因啟動子的研究已經(jīng)取得很大的進展,其輻射的定位作用和可操控性實現(xiàn)了對殺傷基因表達的時空調(diào)控。AIF是1996年發(fā)現(xiàn)的一種凋亡效應分子[5],AIF基因定位于人類Xq25-26,AIF晶體結構研究揭示成熟AIF由3部分構成:具有1個FAD結合結構域(122～262和400～477位氨基酸)、1個NADH結合結構域(263～399位氨基酸)和1個C末端結構域(478～610位氨基酸),其C末端結構域可能與AIF的促凋亡活性有關[12]。本實驗結果顯示:截短型AIF可以誘導MCF-7細胞凋亡,而且可以抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲,這與已有文獻[13]報道的結果基本一致。本實驗結果為利用截短型AIF進行腫瘤基因-放射治療提供了實驗數(shù)據(jù),為乳腺癌的臨床放療提供了新的參考。

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Effects of ionizing radiation on proliferation and invasion of MCF-7 cells transfected with pcDNA3.1-Egr-1-AIF△1-480plasmid

QI Ya-li1,2,LIU Hong-bin3,XIE Zhong-wei3,LIU Yan-jun4,WANG Jian-feng2,5
(1.Department of Epidemiology,School of Public Health,Beihua University,Jilin 132001,China; 2.Key Laboratory of Radiobiology,Ministry of Health,School of Public Health,Jilin University, Changchun 130021,China;3.Jilin Province Jilin(City)Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau, Jilin 132013,China;4.Department of Radiotherapy,People’s Hospital,Changchun City,Changchun 130051,China;5.Department of Radiotherapy,China-Japan Union Hospital, Jilin University,Changchun 130033,China)

ObjectiveTo investigate the influence of truncated apoptosis inducing factor(AIFΔ1-480)on theproliferation and invasion of MCF-7 cells,and to clarify the possibility of promoting cancer gene-radiotherapy. Methods The human breast cancer MCF-7 cells were transfected with AIFΔ1-480recombinant expression vector pcDNA3.1-Egr-1-AIFΔ1-480(pE-AIFΔ1-480)mediated by Egr-1;24 h after 2 Gy X-ray irradiation,MTT assay and Transwell invasion assay were performed to measure the changes of cell proliferation and invasion.The MCF-7 cells were diveded into normal control,pcDNA3.1,p E-AIFΔ1-480,2 Gy irradiation and pE-AIFΔ1-480＋2 Gy irradiation groups.ResultsAfter transfection and 2 Gy X-ray irradiation,the cells proliferated very fast in normal control, pcDNA3.1 and p E-AIFΔ1-480groups,and the proliferation regularity was similar.Compared with normal control group,the cell proliferation abilities were significantly decreased in 2 Gy irradiation and p E-AIFΔ1-480＋2 Gy irradiation groups(P＜0.05),and it was more obvious in p E-AIFΔ1-480＋2 Gy irradiation group,and it was significant lower than that in 2 Gy irradiation group(P＜0.05).The number of the cells permeating membrane was basically same in normal control,pcDNA3.1 and p E-AIFΔ1-480groups;compared with normal control group,they were significantly decreased in 2 Gy irradiation and p E-AIFΔ1-480＋2 Gy irradiation groups(P＜0.05 or P＜0.01); and it was more significant in pE-AIFΔ1-480＋2 Gy irradiation group than that in 2 Gy irradiation group(P＜0.01).ConclusionAIFΔ1-480and ionizing radiation could inhibit the proliferation and invasion of human breast cancer MCF-7 cells,both of them have a synergistic effect,and Egr-1 promoter can enhance the suppression effect under radiation conditions.

Egr-1;truncated apoptosis inducing factor;cell proliferation;invasion;ionizing radiation

R737.9

A

2013-11-30

國家自然科學基金資助課題(30970681);吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目資助課題(2014-192)

齊亞莉(1973－),女,吉林省四平市人,副教授,醫(yī)學博士,主要從事艾滋病和腫瘤放射治療的流行病學研究。

王劍鋒(Tel:0431-85619443,E-mail:jfwang＠jlu.edu.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-0929-04

10.13481/j.1671-587x.20140504