姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中NO和S100β水平的影響

趙朝華,吳樹強(qiáng),茍興春,米亞靜,楊吉平,史利利,成娟娟

(1.西安醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,陜西西安 710021;2.西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科,陜西西安 710077; 3.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化研究所,陜西西安 710021)

姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中NO和S100β水平的影響

趙朝華1,吳樹強(qiáng)2,茍興春3,米亞靜3,楊吉平1,史利利1,成娟娟1

(1.西安醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,陜西西安 710021;2.西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科,陜西西安 710077; 3.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化研究所,陜西西安 710021)

目的:觀察姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中一氧化氮(NO)和S100β水平的影響,探討姜黃素對(duì)缺血性腦損傷保護(hù)作用的機(jī)制。方法:成年SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和姜黃素處理組,每組24只。采用線栓法阻斷大腦中動(dòng)脈(MCAO)2 h誘導(dǎo)建立暫時(shí)性局部腦缺血模型,姜黃素處理組大鼠術(shù)前連續(xù)3 d給予腹腔注射姜黃素溶液,于腦缺血再灌注后24和72 h采用TTC染色觀察腦梗死體積,硝酸還原酶法和ELISA法分別檢測(cè)各組大鼠腦組織中NO和S100β水平。結(jié)果:與模型組比較,姜黃素處理組大鼠腦缺血再灌流24和72 h時(shí)腦梗死體積明顯減小(P＜0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦缺血再灌注24和72 h時(shí)腦組織中NO和S100β水平明顯升高(P＜0.05);與模型組比較,姜黃素處理組大鼠腦缺血再灌注24和72 h時(shí)腦組織中NO水平明顯降低(P＜0.05),腦缺血再灌注72 h時(shí)腦組織S100β水平明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論:姜黃素能明顯減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的程度,降低腦組織中NO和S100β水平,提示腦組織中NO和S100β水平降低可能與姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。

姜黃素;腦缺血再灌注;一氧化氮;S100β

在腦缺血再灌注損傷中一氧化氮(NO)既有擴(kuò)張血管、改善缺血組織血供、抑制血小板凝集和減輕缺血再灌注損傷的作用[1],又有介導(dǎo)和加重缺血再灌注損傷的毒性作用[2],劑量不同作用效果不同。腦內(nèi)S100β水平的改變亦是腦缺血損傷的重要病理學(xué)變化[3]。腦內(nèi)S100β表達(dá)水平與梗死體積呈同步變化;血清S100β水平的升高與腦缺血后神經(jīng)組織損傷程度的進(jìn)程有密切關(guān)聯(lián),S100β水平的升高是引發(fā)腦細(xì)胞進(jìn)一步損傷的重要原因,對(duì)缺血損傷的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有著重要的影響[4],且NO和S100β之間有著密切的聯(lián)系[5]。研究[6]顯示:姜黃素(curcumin)作用于腦缺血的損傷過程可發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)作用,但機(jī)制并不明確。姜黃素對(duì)于腦缺血再灌注后NO和S100β這2種重要分子的影響迄今未見報(bào)道。本研究通過姜黃素預(yù)處理后建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型,研究腦缺血再灌注損傷后腦組織中NO和S100β水平的變化,探討姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑72只健康雄性SD大鼠(SPF級(jí))由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(陜2008-004),鼠齡8～12周,體質(zhì)量240～280 g,實(shí)驗(yàn)前常規(guī)環(huán)境分籠飼養(yǎng)至少7 d。S100βELISA試劑盒(第四軍醫(yī)大學(xué)生理學(xué)教研室提供),S100β單克隆抗體和S100β多克隆抗體均由武漢博士德公司提供。姜黃素購自美國Sigma公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型復(fù)制動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和姜黃素組,每組24只。姜黃素組大鼠于造模前連續(xù)3 d腹腔注射75 mg·kg－1姜黃素溶液(0.1 g·L－1,生理鹽水溶解)1次,模型組(n＝24)給予等體積生理鹽水。參考Longa等[7]描述的管腔內(nèi)線栓技術(shù)閉塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈(MACO)誘導(dǎo)建立暫時(shí)性局部腦缺血大鼠模型。模型制備:大鼠給予10%水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉,做頸部前正中切口,分離暴露右側(cè)頸部血管,用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈,將一端加熱呈光滑球形的3-0尼龍線(寧波醫(yī)用縫線廠)經(jīng)頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈至感到有輕微阻力為止,進(jìn)線長(zhǎng)約18 mm。栓塞2 h后輕輕抽出尼龍線至頸外動(dòng)脈切口處。手術(shù)期間使用電熱毯維持大鼠體溫在36.5℃～37.5℃。大鼠分別存活24和72 h。假手術(shù)組大鼠只分離血管,不插尼龍線。常規(guī)環(huán)境下飼養(yǎng)。MCAO后2 h參照Bederson等[8]方法進(jìn)行神經(jīng)功能損傷程度的評(píng)定,0級(jí):行為正常;1級(jí):提尾懸空左側(cè)前肢屈曲,肩內(nèi)收;2級(jí):抵抗對(duì)側(cè)推力下降,伴前肢屈曲;3級(jí):自發(fā)性側(cè)向旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng),伴抵抗對(duì)側(cè)推力下降和前肢屈曲。評(píng)定為3級(jí)者視為成功腦缺血模型,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 腦組織液制備各組于再灌注24和72 h時(shí)分別取6只大鼠,水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉后,斷頭取腦,用冷生理鹽水沖洗,去除腦膜、小腦,稱質(zhì)量后,制成10%勻漿。15 000 r·min－1離心30 min取上清液,待檢。所有操作在4℃下完成。

1.4 腦梗死體積測(cè)定各組分別于再灌注24和72 h時(shí)處死6只大鼠,斷頭取腦,－20℃冷凍10 min后,行2 mm厚冠狀切片,將切片立即置于預(yù)熱的2%TTC中,于37℃恒溫下避光染色30 min,而后置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定12 h,照相輸入計(jì)算機(jī)。梗死體積百分比＝(對(duì)側(cè)正常組織容積－同側(cè)正常組織容積)/對(duì)側(cè)正常組織容積×100%。

1.5 腦組織中NO和S100β水平測(cè)定將所得腦組織提取液置于721 nm分光光度計(jì),利用硝酸還原酶法呈色,讀取吸光度(A)值,計(jì)算NO水平。所得腦組織提取液通過雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)S100β水平,按S100βELISA試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。各組大鼠腦梗死體積、NO和S100β水平以x ±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦梗死體積腦缺血再灌注24 h時(shí)TTC染色顯示:模型組大鼠未梗塞側(cè)半球正常腦組織呈現(xiàn)鮮紅色,而在栓塞側(cè)半球大腦中動(dòng)脈(MCA)供血區(qū)出現(xiàn)大面積明顯的未被染色的白色缺血梗死區(qū),最大梗死面積主要出現(xiàn)在前囟前和后3 mm之間的部位,梗死區(qū)涉及到額葉、頂葉和顳葉的上外側(cè)皮質(zhì)以及尾殼核等結(jié)構(gòu)。腦缺血24 h 時(shí),姜黃素組大鼠平均腦梗死體積百分比為(10.81±3.92)%,模型組為(19.03±5.74)%,與模型組比較姜黃素組腦梗死體積明顯減小(P＜0.05)。腦缺血72 h時(shí),模型組大鼠腦梗死體積進(jìn)一步擴(kuò)大,姜黃素組腦梗死體積百分比為(17.34± 4.71)%,明顯小于模型組(25.98%±4.97%) (P＜0.05)。見圖1(插頁一)。

2.2 各組大鼠腦組織中NO水平與假手術(shù)組比較,腦缺血再灌注24 h時(shí),模型組和姜黃素組大鼠腦組織中NO水平升高(P＜0.05);72 h時(shí)姜黃素組和模型組大鼠腦組織NO水平升高更為顯著(P＜0.05),但是姜黃素組大鼠腦組織中NO水平在腦缺血再灌注24和72 h后均顯著低于模型組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦組織中NO和S100β水平Tab.1 Levels of NO and s100βin brain tissue of rats in various groups(n＝6,±s)

表1 各組大鼠腦組織中NO和S100β水平Tab.1 Levels of NO and s100βin brain tissue of rats in various groups(n＝6,±s)

?P＜0.05 vs sham operation group;△P＜0.05 vs model group.

Group NO[cB/(μmol·L－1)]S100β[ρB/(μg·L－1)] (t/h) 24 7224 72 Sham operation 17.68±1.89 16.97±2.76 6.68±0.09 6.67±1.36 Model 22.34±3.38?28.56±2.96?8.34±1.38?10.57±1.46?Curcumin 18.45±2.08?△24.71±2.84?△7.41±1.98?8.79±1.24?△

2.3 各組大鼠腦組織中S100β水平與假手術(shù)組比較,大鼠腦缺血再灌注24 h時(shí)模型組和姜黃素組大鼠腦組織中S100β水平升高(P＜0.05),至72 h時(shí)2組S100β水平明顯升高(P＜0.05)。在腦缺血再灌注72 h時(shí)姜黃素組大鼠腦組織中S100β水平明顯低于模型組(P＜0.05)。見表1。

3 討論

本研究結(jié)果顯示:姜黃素預(yù)處理后大鼠腦缺血再灌注后的梗死體積明顯減少,與以往研究[6,9]結(jié)果一致,證明了姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。腦缺血再灌注后腦組織中NO水平在24和72 h持續(xù)升高;姜黃素預(yù)處理后,腦缺血再灌注后同一時(shí)間點(diǎn)腦組織中NO水平明顯降低。腦缺血再灌注24 h時(shí)腦組織中S100β水平略有升高, 72 h時(shí)顯著升高,與NO水平升高亦有一定平行關(guān)系,而姜黃素預(yù)處理后腦缺血再灌注72 h時(shí)腦組織中S100β水平與模型組比較顯著降低。

有研究[10]證實(shí):過量的NO具有神經(jīng)毒性作用,可以抑制核糖核苷酸還原酶或與細(xì)胞中含鐵酶類結(jié)合形成NO-鐵復(fù)合物,抑制細(xì)胞代謝,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡,還可以與超氧陰離子O2－反應(yīng)生成亞硝?；庪x子(ONOO－),而后也可生成OH－和NO2,直接攻擊膜性結(jié)構(gòu)。研究[6,11]證實(shí):創(chuàng)傷區(qū)NO增多,神經(jīng)毒性增強(qiáng)可能是神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要原因之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:腦缺血24 h時(shí)大鼠腦組織中NO水平已明顯升高,之后持續(xù)升高,至72 h NO升高至2倍。隨著NO水平升高大鼠腦梗死體積也在擴(kuò)大。而過多的NO可能通過以上機(jī)制在腦缺血再灌注后期發(fā)揮著加重腦損傷的作用。姜黃素有效地降低了腦缺血再灌注損傷后腦組織中NO水平,可能是其發(fā)揮腦缺血再灌注損傷后腦保護(hù)作用的原因之一。

NO與S100β有著密切關(guān)系,有研究[12]證實(shí): S100β劑量依賴性誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中的一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá),從而誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO,通過NO依賴性通道引起細(xì)胞凋亡。因此本文作者亦檢測(cè)了腦組織中S100β水平變化,結(jié)果顯示:腦缺血再灌注24 h時(shí)大鼠腦組織S100β水平略有升高,72 h時(shí)明顯升高,與NO水平升高有一定平行關(guān)系,可能與上述機(jī)制有關(guān)。而姜黃素預(yù)處理后,腦缺血再灌注72 h時(shí)腦組織中S100β水平明顯低于模型組,說明姜黃素預(yù)處理在腦缺血再灌注后能明顯抑制腦組織中S100β水平。研究[13]表明:過量的S100β在腦缺血損傷中發(fā)揮神經(jīng)毒性作用,說明姜黃素可能同時(shí)通過各種途徑抑制腦缺血再灌注后NO和S100β水平和二者之間的相互作用,這可能是其發(fā)揮腦缺血后神經(jīng)保護(hù)作用的原因之一,但具體的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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Influence of curcumin in NO and S100βlevels in brain tissue of rats after focal cerebral ischemia reperfusion injury

ZHAO Zhao-hua1,WU Shu-qiang2,GOU Xing-chun3,MI Ya-jing3,YANG Ji-ping1, SHI Li-li1,CHENG Juan-juan1
(1.Department of Human Anatomy,Xi’an Medical University,Xi’an 710021,China;2.Department of Thoracic Surgery,Affiliated Hospital,Xi’an Medical University,Xi’an 710077,China; 3.Institute of Foundation and Transformation,Xi’an Medical University,Xi’an 710021,China)

ObjectiveTo observe the influence of curcumin in the levels of nitric oxide(NO)and S100βin the brain tissue of the rats after cerebral ischemia reperfusion,and to explore the neuroprotective mechanism of curcumin.MethodsAdult male SD rats were randomly divided into sham operation group,model group and curcumin group, and 18 rats in every group.Curcumin was intraperitoneally injected daily for 3 consecutive days before inducing focal cerebral ischemia in the SD rats by middle cerebral artery occlusion(MCAO)for 2 h.TTC staining was used toobserve the infarction volume.Nitrate reductase assay was used to detect the level of NO in brain tissue of the rats.The level of S100βin brain was detected by ELISA method.ResultsCompared with model group,the brain infarction volumes of the rats 24 and 72 h after cerebral ischemia reperfusion in curcumin group were significantly decreased(P＜0.05).Compared with sham operation group,the NO and S100βlevels in the brain tissue 24 and 72 h after cerebral ischemia reperfusion of the rats in model group were significantly increased(P＜0.05); compared with model group,the levels of NO in the brain tissue 24 and 72 h after cerebral ischemia reperfusion in curcumin group were remarkably decreased(P＜0.05);compared with modee group,the level of S100βin the brain tissue 72 h after cerebral iscemia reperfusion in curcumin group was remarkably decreased(P＜0.05).ConclusionCurcumin can significantly reduce the degree of ischemia reperfusion injury in the rats and reduce the levels of NO and S100βin brain tissue,which suggests that the decrease of NO and S100βlevels in brain tissue may be associated with the neuroprotective effect of curcumin.

curcumin;cerebral ischemia reperfusion;nitric oxide;S100β

R363;R965

A

2014-01-15

國家自然科學(xué)基金資助課題(81071060);陜西省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(2013JQ3017);西安醫(yī)學(xué)院科研基金資助課題(10FC012)

趙朝華(1978－),女,陜西省西安市人,講師,醫(yī)學(xué)碩士,主要從事腦缺血性疾病發(fā)病機(jī)制和防治方面的研究。

茍興春(Tel:029-6177472,E-mail:gouxingchun＠189.cn)

時(shí)間: 2014-08-27 14:46

網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.R.20140827.1446.005.html

1671-587Ⅹ(2014)05-0925-04

10.13481/j.1671-587x.20140503