PB法篩選保加利亞乳桿菌增殖培養(yǎng)基的研究

陳 合， 陳世偉， 李串娜， 舒國偉

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

近年來，酸乳制品因其具有保健、長壽、美容以及醫(yī)藥應(yīng)用的效果而倍受消費(fèi)者青睞，市場前景十分廣闊[1,2].保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus) 是用于酸乳發(fā)酵的主要菌種之一，其通過發(fā)酵鮮奶產(chǎn)酸、產(chǎn)胞外多糖以及風(fēng)味物質(zhì)，賦予酸奶獨(dú)特的風(fēng)味、良好的質(zhì)地和細(xì)膩的口感.同時，其具有調(diào)節(jié)人體胃腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)消化吸收、增強(qiáng)免疫功能、抗癌抗腫瘤等重要的生理保健功能，因而受到更多人的關(guān)注[3].

在酸乳生產(chǎn)中，開發(fā)高活性、低成本酸奶直投式發(fā)酵劑備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，而該工作首先必須獲得能夠使乳酸菌快速生長的增菌培養(yǎng)基[4].乳酸菌增菌培養(yǎng)基的研究國內(nèi)外具有不同的方法.如程艷宇[3]等人，通過優(yōu)化MRS培養(yǎng)基中Mg，Mn和Fe 3種微量元素的配比，實(shí)現(xiàn)了保加利亞乳桿菌的增殖.劉海燕[5]、呂加平[6]等人使用番茄汁、胡蘿卜汁、啤酒等物質(zhì)對植物乳桿菌等乳酸菌進(jìn)行了增殖研究，并取得了一定成果.安莉[7]等人以17種氨基酸與牛乳的復(fù)合物為主要材料，研究了氨基酸對保加利亞乳桿菌生長的影響，證明絲氨酸、賴氨酸、亮氨酸與牛乳復(fù)合時對保加利亞乳桿菌促生長作用明顯.Claire L.V.[8]、周景欣[9]等人經(jīng)過體外試驗(yàn)、臨床研究發(fā)現(xiàn)，低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、大豆低聚糖等對人體腸內(nèi)乳酸桿菌均有明顯的增殖作用.另有研究者[10,11]利用保加利亞乳桿菌發(fā)酵不同蔬菜來研究蔬菜對其增殖的影響，取得了一定的成果.

本課題組前期從牛乳發(fā)酵劑中篩選獲得了能顯著降低羊乳膻味和改善羊乳質(zhì)地的發(fā)酵菌株，并對其凝固羊乳發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化[12]，通過添加嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌等適宜菌株研究了羊乳發(fā)酵的條件[13].本文采用保加利亞乳桿菌(LB)為試驗(yàn)菌株，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計方法，對7種碳源/益生元和8種氨基酸進(jìn)行了篩選，以期獲得影響LB增菌的碳源/益生元和氨基酸，為進(jìn)一步優(yōu)化保加利亞乳桿菌增菌培養(yǎng)基和制備直投式酸羊奶凍干發(fā)酵劑提供技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基

保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus，LB)，由本實(shí)驗(yàn)室前期分離篩選，適宜用于羊奶發(fā)酵.

MRS培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，液體培養(yǎng)基用于LB的活化，瓊脂培養(yǎng)基用于其計數(shù).

LB發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖5.43 g，蛋白胨0.98 g，磷酸氫二鉀0.59 g，蒸餾水100 mL，pH值6.4～6.6.118 ℃滅菌15 min.用于LB的基礎(chǔ)培養(yǎng).

1.1.2 主要試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)中各種糖類、氨基酸以及上述培養(yǎng)基中所用試劑均為生化試劑級.DH5000AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-1F 無菌操作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DH5000AB 電手提式蒸汽壓力滅菌器：江陰濱江醫(yī)療器械廠；722型光柵分光光度計：上海第三分析儀器廠；PB-10酸度計：賽多利斯(北京)科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及培養(yǎng)

MRS培養(yǎng)基經(jīng)118 ℃滅菌15 min，放于冰箱備用.取保加利亞乳桿菌(LB)的凍干菌粉，在無菌條件下，以2%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h.鏡檢確定無雜菌，再重復(fù)轉(zhuǎn)接3次至活力穩(wěn)定，即可達(dá)到活化目的.

1.2.2 保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用PB設(shè)計進(jìn)行分類篩選，以LB發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為培養(yǎng)基，優(yōu)化碳源(乳糖、低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、水蘇糖及菊糖7種)、氨基酸(羥脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及谷氨酸8種).以上實(shí)驗(yàn)接種量均為3%，35 ℃培養(yǎng)20 h后，測定其pH、OD值及活菌數(shù).每組做3個平行，以活菌數(shù)為響應(yīng)值，確定最優(yōu)的碳源及氨基酸.

1.2.3 菌體濃度測定

(1)活菌計數(shù)法：采用固體MRS培養(yǎng)基，梯度稀釋平板計數(shù)法分別對LB進(jìn)行計數(shù).

(2)分光光度法：取增菌培養(yǎng)液，以未接種的空白培養(yǎng)基為對照，采用可見光分光光度計，在波長600 nm下比色而得.

1.2.4 培養(yǎng)液pH值的測定

采用PB-10酸度計，室溫下直接測定發(fā)酵液pH值，每份3個平行.

1.2.5 碳源/益生元影響因子的篩選

選取N=12的PB設(shè)計，以葡萄糖(X1)，乳糖(X2)，低聚木糖(X3)，低聚果糖(X4)，低聚半乳糖(X5)，低聚異麥芽糖(X6)，水蘇糖(X7)，菊糖(X8)8個因素為考察對象，并以活菌數(shù)(Y)為響應(yīng)值，各因素分別取高(+)、低(-)兩個水平，低水平設(shè)置為原始的培養(yǎng)條件，高水平是低水平的2倍，12次試驗(yàn)中，菌體均在35 ℃下培養(yǎng)20 h后，測定其pH、OD及活菌數(shù)，每組設(shè)3個平行.各個因素的編碼水平見表1所示.

表1 碳源/益生元PB因素水平表

1.2.6 氨基酸影響因子的篩選

菌體的生長除了碳源外，還需要氨基酸、維生素等物質(zhì)，它們能對菌體的生長起到一定的促進(jìn)作用.采用9因素兩水平、N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計，對羥脯氨酸(X1)、精氨酸(X2)、亮氨酸(X3)、絲氨酸(X4)、天冬氨酸(X5)、酪氨酸(X6)、谷氨酸(X8)、苯丙氨酸(X9)等進(jìn)行研究.其中(X7)是虛擬項(xiàng)，以減少誤差.活菌數(shù)(Y)為響應(yīng)值，篩選出影響較大的因素.35 ℃下培養(yǎng)20 h后，測定其活菌數(shù)及pH，每組設(shè)3個平行.各個因素的編碼水平見表2所示.

表2 氨基酸類PB因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源/益生元影響因子篩選結(jié)果分析

試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表3所示.OD和pH作為參考值，活菌數(shù)為響應(yīng)值.

表3 碳源/益生元PB試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

使用SAS軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，如表4所示.結(jié)果顯示，各個因素對LB生長的影響強(qiáng)弱為：X1>X8>X4>X6>X2>X5>X7>X3.其中X1(p=0.033)是影響LB生長的顯著因素，X4(p=0.091)、X8(p=0.061)均為重要因素.X1、X4、X8對LB生長影響均呈正效應(yīng)(如圖1所示).

上述結(jié)果中菊糖、低聚果糖對LB的增菌影響與周景欣[14]、呂利軍[15]等人的研究結(jié)果相似，均對乳桿菌具有增菌作用；葡萄糖、乳糖的增菌作用與史媛英[16]的研究結(jié)果有差異，本實(shí)驗(yàn)中葡萄糖的影響更加顯著，乳糖的作用較小且呈負(fù)效應(yīng)(T=-1.265)，這種差異可能是菌種不同所導(dǎo)致.

表4 碳源/益生元PB設(shè)計試驗(yàn)方差分析

圖1 碳源/益生元95%的CI 區(qū)間圖

2.2 氨基酸影響因子篩選結(jié)果分析

試驗(yàn)設(shè)計和結(jié)果見表5所示，分析時以活菌數(shù)為響應(yīng)值.

表5 氨基酸類PB試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)SAS軟件分析得到圖2，由圖2可知，剔除X7虛擬項(xiàng)后的八個因素，其中前三個因素即谷氨酸(X8)、羥脯氨酸(X1)和酪氨酸(X6)，條帶較長，即對LB生長的影響較大.且X1、X6 對響應(yīng)值Y呈正效應(yīng)，而影響最大的X8則呈負(fù)效應(yīng)(T=-1.005),如圖3所示.

上述結(jié)果與安莉[7]等人的研究結(jié)果不同，在本實(shí)驗(yàn)中絲氨酸、賴氨酸的影響相對于谷氨酸、羥脯氨酸和酪氨酸較小，且亮氨酸呈負(fù)效應(yīng).

圖2 PB試驗(yàn)設(shè)計氨基酸類主因子篩選主次圖

圖3 氨基酸類95%的CI區(qū)間圖

3 結(jié)論

采用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計，從7種碳源/益生元和8種氨基酸中分別篩選出顯著影響保加利亞乳桿菌增殖的因子.結(jié)果表明，葡萄糖、低聚果糖、菊糖、酪氨酸和羥脯氨酸等有利于保加利亞乳桿菌的生長，概率水平>90%，且對菌體的累積呈正效應(yīng)，其中影響最顯著的碳源為葡萄糖(p=0.033)，概率水平>95%；谷氨酸的添加對保加利亞乳桿菌的生長有顯著的抑制作用，在直投式酸羊乳凍干發(fā)酵劑制備中其添加量受到限制.

[1] 吳祖芳，郭 陽.發(fā)酵乳的功能與特性[J].中國乳品工業(yè),

1994,22(5):216-220.

[2] 徐心軍,林金資.嗜酸乳桿菌的療效作用及其應(yīng)用[J].中國乳品工業(yè),1990,18(5):237-238,232.

[3] 程艷宇，李 妍，劉曉輝，等.優(yōu)良保加利亞乳桿菌菌株的篩選及增殖培養(yǎng)[J].中國乳品工業(yè),2010,38(7):11-14.

[4] 萬紅兵,田洪濤,馬樂輝,等.保加利亞乳桿菌番茄復(fù)合汁增菌培養(yǎng)基的優(yōu)選研究[J].中國乳品工業(yè),2006,34(8):14-17.

[5] 劉海燕,徐幸蓮,盧士玲.Plackett-Burman(PB)優(yōu)化植物乳桿菌增殖培養(yǎng)基的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24(12):1 277-1 280.

[6] 呂加平,梁占東,駱承庠.乳酸菌增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化設(shè)計[J].中國乳品工業(yè),1999,27(3):12-15.

[7] 安 莉,呂嘉櫪,李旭華.氨基酸與牛乳復(fù)合對保加利亞乳桿菌生長的影響[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報,2009,27(1):65-67.

[8] Claire L.V,Gibson G.R,Rastall R.A.Carbohydrate preference,acid tolerance and bile tolerance in five strains of Bifidobacterium[J].Journal of Applied Microbiology,2006,100(4):846-853.

[9] 周景欣.幾種益生元制劑對腸道菌群作用效果的研究[D].大連：大連醫(yī)科大學(xué),2007.

[10] Nancy J Gardner，Tony Savard，Paule Obermeier.Selection and characterization of mixed starter cultures for lactic acid fermentation carrot，cabbage，beet and onion vegetable mixtures[J].International Journal of Food Microbiology，2001，64(3):261-275.

[11] 賀稚非，向瑞璽，李洪軍.泡菜活性直投式乳酸菌發(fā)酵劑的研究[J].食品科學(xué)，2006，27(8):191-197.

[12] 陳 合，王長鳳，舒國偉，等.凝固型酸羊奶發(fā)酵工藝的優(yōu)化[J].食品科技，2010，35(12):71-74.

[13] 陳 合，張秋紅，王長鳳，等.溫度對嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵羊奶的影響[J].食品與機(jī)械,2013，29(1):23-26.

[14] 周景欣,袁杰利,李新倉.幾種益生元制劑對腸道菌群作用效果的研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2008,20(2):145-146,153.

[15] 呂利軍,季海峰,張董燕,等.菊粉對植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌生長的影響[J].飼料研究,2008,31(4):36-38.

[16] 史媛英,肖冬光.酸奶發(fā)酵劑高濃度培養(yǎng)的研究[J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報,1999,14(1):20-25