成人斯蒂爾病患者血清中MIF、IL-6檢測及臨床意義

許國飛，毛桐俊，盛 君，王 萍，董 群

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002;2.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，安徽 蕪湖 241001)

成人斯蒂爾病 (adult onset Still′s disease，AOSD)是一種病因及發(fā)病機制不明的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛和(或)關(guān)節(jié)炎、皮疹、咽痛、肝脾及淋巴結(jié)腫大、白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞增多、血清鐵蛋白明顯升高，嚴(yán)重者可伴多系統(tǒng)損害的全身綜合征。臨床缺乏特異性診斷指標(biāo)，需排除感染性疾病、腫瘤及其他結(jié)締組織疾病。感染等環(huán)境因素激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)/單核吞噬系統(tǒng)活化，大量巨噬細(xì)胞被激活，出現(xiàn)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-l、IL-18等大量細(xì)胞因子釋放，導(dǎo)致各種AOSD臨床表現(xiàn)[1]。如不及時治療，嚴(yán)重者可出現(xiàn)威脅生命的并發(fā)癥，如成人呼吸窘迫綜合征[2]、噬血細(xì)胞綜合征等[3]。

巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)能促進(jìn)炎癥反應(yīng)，是具有多種調(diào)節(jié)效應(yīng)的前炎癥因子。越來越多的研究表明MIF是一廣譜的促炎因子，可調(diào)節(jié)多種炎癥且炎癥調(diào)節(jié)因子處于整個細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的上游，因此其在自身免疫性疾病中的作用地位越來越受到關(guān)注。本研究運用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對32例病情活動期AOSD患者、26例病情穩(wěn)定期AOSD患者及20例健康志愿者血清中MIF、IL-6水平進(jìn)行檢測，探索MIF與AOSD活動性之間的聯(lián)系，并與IL-6水平比較。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院風(fēng)濕免疫科2012年8月～2013年12月確診的32例病情處于活動期AOSD患者，其中男性7例，女性25例，年齡17～62歲，平均(34±23)歲，病程14 d～19年不等，平均(1.52±1.33)年，每例采集外周血3 ml，自然凝固，離心后取血清置-20℃冰箱保存。對上述患者進(jìn)行隨訪，于2013年10～12月對病情處于穩(wěn)定期的26例患者采取血清標(biāo)本。收集20例健康志愿者血清作為對照，其中男性6名，女性14名，年齡18～56歲，平均年齡(31±24)歲?；顒悠贏OSD組、穩(wěn)定期AOSD組與健康對照組在年齡、性別方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

所有AOSD患者診斷均符合1992年日本標(biāo)準(zhǔn)即Yamaguchi標(biāo)準(zhǔn)[4]?；顒悠贏OSD患者有發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、皮疹等臨床表現(xiàn)，同時白細(xì)胞總數(shù)增多、血清鐵蛋白升高、血沉加快。穩(wěn)定期AOSD納入標(biāo)準(zhǔn)參照國外的緩解標(biāo)準(zhǔn)[3]：完全緩解(CR)為臨床癥狀如發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、咽痛、皮疹、淋巴結(jié)腫大完全緩解；實驗室檢查中性粒細(xì)胞、肝功能指標(biāo)、血清鐵蛋白(SF)降至正常水平或下降幅度≥50%。收集活動期AOSD患者及穩(wěn)定期AOSD患者臨床資料。

1.2 研究方法 用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測所采集血清中MIF、IL-6水平，檢測所用試劑盒由上海永葉生物科技有限公司提供，按操作說明進(jìn)行檢測。96孔板各孔預(yù)先包被檢測抗體。操作時試劑盒置于室溫平衡20 min，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本(用樣本稀釋液稀釋5倍)各50 μl。標(biāo)準(zhǔn)品孔使用復(fù)孔檢測，獲得數(shù)據(jù)取平均值計入。向各包被微孔中加入HRP標(biāo)記的檢測抗體。用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱溫育60 min，用稀釋20倍的洗滌緩沖液洗板5次，洗板后加底物TMB顯色，37℃避光溫育15 min，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色。最后加終止液終止反應(yīng)。15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的OD值。用酶聯(lián)免疫檢測儀(波長450 nm)讀數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出MIF、IL-6的含量。

2 結(jié)果

2.1 AOSD患者血清中MIF的水平 在32例活動期AOSD患者中，血清MIF水平為(63.6±16.7)ng/ml，隨訪的26例病情完全緩解的AOSD患者中，血清MIF水平 (31.3±9.2) ng/ml，健康對照組(11.9±7.3)ng/ml，且各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體情況見表1。

2.2 AOSD患者血清中IL-6的水平 在32例活動期AOSD患者中，血清IL-6水平為(22.4±5.5)pg/ml，隨訪的26例病情完全緩解的AOSD患者中，血清IL-6水平 (15.7±4.3) pg/ml，健康對照組(10.6±5.1)pg/ml，且各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體情況見表1。

組別nMIF(ng/ml)IL-6(pg/ml)AOSD活動組3263.6±16.7ab22.4±5.5abAOSD穩(wěn)定組2631.3±9.2c15.7±4.3c對照組2011.9±7.310.6±5.1F值113.49935.484P值0.0000.000

注：a與AOSD穩(wěn)定期比較，P<0.05；b與對照組比較，P<0.05； c與對照組比較，P<0.05

2.3 活動期AOSD患者血清MIF、IL-6水平與實驗室指標(biāo)的相關(guān)性分析 在32例活動期AOSD患者中，ESR水平為(74.0±22.2)mm/h，CRP水平為(84.9±49.1) mg/L，PLT水平為(243.8±62.1)×109/L,WBC水平為(16.0±6.9)×109/L, SF水平為(1 638.3±394.4) ng/ml。為進(jìn)一步探討血清MIF、IL-6水平與AOSD病情活動之間相關(guān)性，與臨床上AOSD常用活動性參數(shù)ESR、CRP、PLT、WBC、SF進(jìn)行相關(guān)性分析，除MIF與WBC有相關(guān)性之外，其他均無相關(guān)性，具體情況見表2。

3 討論

目前AOSD的病因和發(fā)病機制不明，有學(xué)者傾向于Th1/Th2細(xì)胞失衡，Th1型免疫應(yīng)答在AOSD發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[6]，這提示單核巨噬系統(tǒng)活化成為AOSD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)MIF的主要來源是垂體促腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和活化的T淋巴細(xì)胞，肝、腎、脾等器官組織的實質(zhì)細(xì)胞、組織細(xì)胞也可以產(chǎn)生和表達(dá)巨噬細(xì)胞移動抑制因子[7]。在未受刺激的單核細(xì)胞和靜息巨噬細(xì)胞里存在大量巨噬細(xì)胞移動抑制因子蛋白前體，當(dāng)感染和應(yīng)激反應(yīng)時，下丘腦-垂體-腎上腺軸活化，MIF從垂體細(xì)胞中釋放(中樞性)，同時在感染后體內(nèi)存在的細(xì)菌內(nèi)、外毒素如脂多糖、毒性休克綜合征毒素-1、鏈球菌致熱外毒素A和細(xì)胞因子(如TNF-α)刺激下，單核巨噬細(xì)胞釋放大量MIF(外周性)，MIF即可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和活化的T細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6等)，誘導(dǎo)產(chǎn)生環(huán)氧化酶途徑的中間產(chǎn)物，還能引起基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，極大地促進(jìn)炎癥和免疫反應(yīng)[8]。NF-κB是具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白，可調(diào)控多種炎細(xì)胞因子的表達(dá)。巨噬細(xì)胞移動抑制因子通過抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)IκB合成，促使NF-κB進(jìn)入核內(nèi)和相應(yīng)DNA序列結(jié)合而釋放大量炎性因子[8]。

表2 活動組AOSD患者M(jìn)IF、IL-6水平與實驗室指標(biāo)的相關(guān)性分析

本研究通過對活動期AOSD患者、穩(wěn)定期AOSD患者及健康志愿者血清中MIF水平檢測，發(fā)現(xiàn)活動期AOSD患者血清中MIF水平顯著高于穩(wěn)定期AOSD及健康對照，結(jié)果提示MIF參與AOSD發(fā)病。結(jié)合患者臨床資料，我們發(fā)現(xiàn)MIF顯著升高患者病情亦頑固。MIF水平在疾病活動期顯著增高，病情緩解期MIF的水平隨之下降。有研究表明[9]AOSD復(fù)發(fā)時，MIF水平升高，所以MIF水平與疾病活動相關(guān)，可作為判斷疾病活動的一項重要指標(biāo)，同時也是AOSD病情變化的一個良好監(jiān)測指標(biāo)。

本研究活動期AOSD患者M(jìn)IF與WBC呈正相關(guān)，而與IL-6、ESR、CRP、PLT、SF間無相關(guān)性，活動期AOSD患者IL-6與MIF、WBC、ESR、CRP、PLT、SF間均無相關(guān)性，未能證實MIF與IL-6、ESR、CRP、PLT、SF間相關(guān)性，考慮可能與樣本量不足，患者病情輕重不一及臨床表現(xiàn)多樣化有關(guān)。目前公認(rèn)MIF作為前炎癥因子，抑制MIF生成將有助于病情緩解。研究資料表明[8]，皮質(zhì)醇和MIF水平在一定范圍內(nèi)成正相關(guān)，體外實驗證實低濃度的地塞米松可誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞生成MIF，高濃度的地塞米松則可完全抑制脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞生成MIF。說明MIF/皮質(zhì)類固醇激素的相互作用和平衡在調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應(yīng)中具有重要作用。這也為糖皮質(zhì)激素治療AOSD提供了理論依據(jù)。開發(fā)MIF靶向治療有助于AOSD患者病情緩解。

綜上所述，血清MIF水平在AOSD患者中顯著增高，并與病情活動相關(guān)，是良好的監(jiān)測指標(biāo)。MIF在AOSD疾病的發(fā)病機制中可能發(fā)揮著重要的作用。加強MIF及抗MIF抗體作用的研究，可為AOSD治療提供一條新的可行途徑，在治療AOSD等自身免疫性疾病方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

【參考文獻(xiàn)】

[1] COLAFRANCESCO S,PRIORI R,ALESSANDRI C,etal.IL-18 Serum Level in Adult Onset Still′s Disease:A Marker of Disease Activity[J].Int J Inflam,2012,2012:156-890.

[2] SULEIMAN M,WOLFOVITZ E，BOULMAN N,etal.Adult onset Still′s disease as a cause of ARDS and acute respiratory failure[J].Scand J Rheumatol,2002,31:181-183．

[3] ARLET JB,LE TH,MARINHO A,etal.Reactive haemophagocytic syndrome in adult-onset Still′s disease：a report of six patients and a review of the literature[J].Ann Rheum Dis,2006,65:1596-1601．

[4] YAMAGUCHI M,OHTA A,TSUNEMATSU T,etal.Preliminary criteria for classification of adult Still′s disease[J].J Rheumatol,1992,19:424-428．

[5] FAUTREL B,SIBILIA J,MARIETTE X,etal.Tumour necrosis factor α blocking agents in refractory adult Still′s disease：an observational study of 20 cases[J].Ann Rheum Dis,2005,64:262-266．

[6] EFTHIMIOU P,KONTZIAS A,WARD CM,etal.Adult-onset Still′s disease：can recent advances in our understanding of its pathogenesis lead to targeted therapy[J]? Nat Clin Pract Rheumatol,2007,3:328-335.

[7] BAUGH JA,BUCALA R. Macrophage migration inhibitory factor[J].J Cnit Care Med,2002,30(1 Suppl):S27-S35.

[8] 方芳,陳偉英.巨噬細(xì)胞移動抑制因子在機體炎癥反應(yīng)中的作用及其機制[J]. 國外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊,2004,31(5):210-213.

[9] 鄒玉瓊,呂良敬,楊程德.巨噬細(xì)胞游走抑制因子與成人斯蒂爾病病情活動的相關(guān)性研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2007,11(12):705-708.