茶渣發(fā)酵菌株的篩選、鑒定及生物學(xué)分析

胡桂萍， 楊 廣， 宋鳳琴， 方雅君， 黃瓊瑤， 尤民生, 石旭平(.福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)所, 福建 福州 35000; .江西省蠶桑茶葉研究所, 江西 南昌 3300)

茶葉作為我國特有飲料，為功能性保健食品，經(jīng)分析茶葉中含有咖啡堿、單寧、茶多酚、蛋白質(zhì)、碳水化合物、游離氨基酸、葉綠素、胡蘿卜素、維生素B、維生素C、維生素E、維生素P以及無機(jī)鹽、微量元素等400多種成分。因此大量的茶飲食品，茶醫(yī)藥產(chǎn)品，茶日化用品等深加工產(chǎn)品被開發(fā)，茶產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展。然而隨著茶葉深加工生產(chǎn)的同時(shí)產(chǎn)生了大量的茶渣。如何對(duì)茶渣進(jìn)行有效利用，是茶產(chǎn)業(yè)部門和茶葉科研工作亟需解決的課題。目前，已有利用茶渣為原料提取茶蛋白，茶纖維，或者利用茶渣開發(fā)生產(chǎn)肥料的研究報(bào)道(羅紅玉等，2010；王素霞，2006；周小玲等，2007；沈連清等2007；蔡志寧等，2008)。其中，利用茶渣生產(chǎn)茶菌肥，通過微生物發(fā)酵，將廢茶渣全部消化，使剩余的有效成分回歸土壤，減少茶渣的環(huán)境污染，不僅符合生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展需求，更有利于提高茶葉生產(chǎn)的附加值。浙江大學(xué)茶學(xué)系通過微生物發(fā)酵后并添加適量的N、P、K元素，成功開發(fā)有機(jī)——無機(jī)復(fù)混肥(屠幼英和陳利燕，2009)。而茶渣開發(fā)生產(chǎn)肥料的關(guān)鍵在于發(fā)酵菌株的選擇。有效的發(fā)酵菌株，不僅有助于茶渣有機(jī)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，還能刺激作物生長，提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)及抗病性。邱富林等(2008)將茶渣有機(jī)無機(jī)復(fù)合肥進(jìn)行椪柑生產(chǎn)的田間試驗(yàn)得到該肥料可促進(jìn)椪柑新梢生長、提高其產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，已報(bào)道用于茶渣生產(chǎn)茶菌肥的發(fā)酵菌株較少，加大茶菌肥發(fā)酵微生物的篩選和收集是茶菌肥產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)前提，本實(shí)驗(yàn)以福建大閩食品公司提供的廢茶渣為原料，添加兔糞作為氮源，固態(tài)高溫發(fā)酵生物肥，并從中分離發(fā)酵微生物，對(duì)其進(jìn)行鑒定和生物學(xué)分析，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)茶菌肥資源化利用提供菌株來源和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶渣來源 茶渣由福建大閩食品公司提供

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖 20 g，水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 以茶渣為碳源，兔糞為氮源，3:1體積混合，置于60 ℃固體發(fā)酵2個(gè)月。

1.2.2 茶渣發(fā)酵微生物的分離 茶渣發(fā)酵菌株的分離方法如下：取已被發(fā)酵過的茶渣至于馬鈴薯培養(yǎng)基上，至于60 ℃培養(yǎng)箱中，厭氧培養(yǎng)3-5 d。用接種針挑取形態(tài)不同的菌株的菌絲分別輕點(diǎn)到馬鈴薯培養(yǎng)基中， 置于60 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5 d，純化2-3次。

1.2.3 茶渣發(fā)酵菌株的ITS鑒定 茶渣發(fā)酵菌株的ITS鑒定參照邢紅梅等(2009)，具體步驟如下：

(1)菌絲體的培養(yǎng)與收集：菌株接種在PDA培養(yǎng)基上活化，于60 ℃暗培養(yǎng)3-5 d后，用滅菌解剖刀刮取菌絲，置于5 mL塑料離心管中，真空冷凍干燥24-48 h后，在離心管中用玻璃棒將其搗碎成菌絲粉，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)真菌DNA的提?。喝「鞔郎y(cè)菌株的菌絲粉0.2 g分別置1.5 mL的Eppendorf管中，加900 μL CTAB提取液，90 μL 10%的SDS溶液，振蕩混勻，55℃水浴1 h，12 000 r/min離心15 min。取上清液，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，輕輕顛倒混勻，12000 r/min離心10 min。取上清液加等體積氯仿輕輕混勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液加入1/10體積的NaAc、2倍體積的冰乙醇，在-20℃下沉淀1 h，12 000 r/min離心10 min。棄上清液，70%的乙醇洗滌1次，干燥后溶于30 μL雙蒸水中備用。

(3)ITS擴(kuò)增：用真核生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其序列為ITS1: 5'-TCCGTAG-GTGAACCTGCGG-3', ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

(4)PCR反應(yīng)條件：PCR的反應(yīng)混合液的總體積為25 μL，包括相應(yīng)濃度的模板DNA，0.15 μmol引物，4種dNTP各50 μmol，2.5 μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液，2 mmol Mg2+, 1.25單位Taq酶(Promega)，混合離心后加1滴礦物油，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共31個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。

膠回收PCR產(chǎn)物，連接在PMD182T載體上，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，在加有Amp的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。用菌落PCR驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子，并委托上海生物有限責(zé)任公司測(cè)序。

(5)ITS序列分析：將菌株的核糖體DNA-ITS序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.gov.blast)進(jìn)行同源性比較。同時(shí)用MEGA5.1構(gòu)建分子發(fā)育系統(tǒng)樹。

1.2.4 茶渣發(fā)酵菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 將真菌接種到PDA培養(yǎng)基上，60 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)與顏色，再在顯微鏡下觀察其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子梗著生情況及孢子形態(tài)、大小、顏色等。

1.2.5 發(fā)酵菌種生長曲線測(cè)定 將篩選到的發(fā)酵菌株，C-1，C-2，C-3和C-4，接種于含有茶渣浸提液的PDA固體培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定點(diǎn)采用十字交叉法測(cè)量菌落生長直徑，每個(gè)菌株接種三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶渣發(fā)酵菌株的分離

以茶渣為碳源，兔糞為氮源，3:1體積混合，置于60℃發(fā)酵2個(gè)月，經(jīng)PDA培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，共分離到4株真菌，分別為C-1，C-2，C--3，C-4。菌落形態(tài)如圖1所示，菌株C-1菌落棉絮狀，黃色；菌株C-2，絨毛狀，白色；菌株C-3棉絮狀，暗灰色；菌株C-4菌落棉絮狀，乳白色。

2.2 茶渣發(fā)酵菌株的ITS鑒定

提取發(fā)酵菌株C-1，C-2，C-3，C-4的基因組DNA，并進(jìn)行ITS擴(kuò)增，得到大小約為600 bp擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI中的GeneBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)，從比對(duì)結(jié)果可知，分離得到四株的真菌C-1，C-2，C-3，C-4分別隸屬于米曲霉(Aspergillusoryzae)、毛霉菌(Mucormucedo)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。通過軟件MEGA5對(duì)發(fā)酵菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，見圖3。

圖2發(fā)酵菌株的ITS片段的擴(kuò)增圖3發(fā)酵菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Figure 2 ITS fragments amplification of fermenting strains Figure 3 The phylogenetic tree of fermenting strains

2.3 茶渣發(fā)酵菌株形態(tài)學(xué)特征

電鏡下對(duì)4株發(fā)酵菌株進(jìn)行菌絲和孢子形態(tài)進(jìn)行微觀觀察，見圖4和圖5，菌株C-1菌絲為有隔菌絲，孢子棒球形；菌株C-2菌絲為管狀分枝的無隔菌絲，形成球形、橢圓形、壁薄、光滑的孢囊孢子；菌株C-3菌絲為有隔菌絲，孢子為分生孢子，圓形；菌株C-4菌絲為氣生菌絲，孢子為厚垣孢子。

圖4 茶渣發(fā)酵菌株的菌絲形態(tài)Figure 4 Mycelial morphological characters of fermenting strains

圖5 茶渣發(fā)酵菌株的孢子形態(tài)Figure 5 Spore morphological characters of fermenting strains

2.4 發(fā)酵菌株生長曲線

將4株發(fā)酵菌株接種在含有茶渣濾液的固體PDA平板上生長，檢測(cè)其生長情況，如圖6，菌株C-2生長最快，第4天開始菌落直徑就超過6 cm，并于第6天菌落直徑達(dá)到8 cm；其次依次為菌株C-4，C-3；而菌株C-1生長最慢，第7天菌落直徑還未達(dá)到7 cm。

圖6 發(fā)酵菌株的生長曲線Figure 6 Growth curve of fermenting strains

3 討論

利用微生物發(fā)酵的方法來處理茶渣，使得茶渣中氨基酸含量提高，纖維素含量減少，開發(fā)出不同種類飼料添加劑是茶產(chǎn)業(yè)實(shí)際生產(chǎn)中值得開發(fā)和研究的課題，目前相關(guān)研究有，但是不多，主要的技術(shù)難題是缺乏有效的發(fā)酵菌種和相關(guān)的發(fā)酵工藝。本研究模擬堆肥發(fā)酵，從廢茶渣發(fā)酵堆中篩選到四種發(fā)酵真菌，米曲霉(Aspergillusoryzae)、毛霉菌(Mucormucedo)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。對(duì)其在含有茶渣濾液的PDA固體培養(yǎng)基生長曲線測(cè)定發(fā)現(xiàn)，菌種毛霉菌生長最快，該菌種可能在茶渣茶菌肥資源化產(chǎn)業(yè)中具有重要的應(yīng)用前景。Amit等(2009)也利用固態(tài)發(fā)酵，篩選到一株黑曲霉(AspergilusnigerARNU-4)可將茶渣生產(chǎn)葡糖酸。邱深本(2005)用木霉菌發(fā)酵除去木質(zhì)素后的茶渣和廢茶，并進(jìn)行飼喂動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物可以為動(dòng)物提供52%以上的營養(yǎng)物質(zhì)。劉姝和涂國全(2001)采用微生物固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，利用茶渣為主料，以曲霉和木霉為發(fā)酵菌種，通過固態(tài)發(fā)酵可以米曉娜改善茶渣蛋白含量和營養(yǎng)價(jià)值。篩選有效的茶渣發(fā)酵菌株，并采用微生物固體發(fā)酵是茶渣廢棄物質(zhì)開發(fā)利用成有利用物質(zhì)，如飼料添加劑，茶菌肥等，新的有效的利用途徑。

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