眼鏡蛇毒對成年大鼠脊神經(jīng)節(jié)BDNF和c-jun表達(dá)的影響

周榮海，丁 見，熊克仁

(皖南醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

眼鏡蛇毒是眼鏡蛇毒腺分泌的毒液，具有血液毒性和神經(jīng)毒性[1]。蛇毒可以改變周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的興奮傳遞，從而影響正常的神經(jīng)調(diào)節(jié)活動[2]。脊神經(jīng)節(jié)是機(jī)體內(nèi)、外環(huán)境與脊髓連結(jié)的紐帶，接受外周初級感覺信息的傳入進(jìn)而將其傳送到中樞。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neorotrop-hin factors,BDNF)是豬腦中分離出來的一種堿性蛋白，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員，對神經(jīng)元有維持和修復(fù)功能。即刻早基因(immediate early response genes,IEGs)c-jun是參與周圍神經(jīng)系統(tǒng)功能活動的調(diào)控基因之一，正常情況下表達(dá)非常少，但機(jī)體受到刺激時其表達(dá)會增多[3]。目前，尚未見有關(guān)眼鏡蛇毒對脊神經(jīng)節(jié)中BDNF和c-jun表達(dá)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)方法觀察眼鏡蛇毒對脊神經(jīng)節(jié)BDNF和c-jun表達(dá)的影響，為探討眼鏡蛇毒中毒機(jī)制提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蛇毒 眼鏡蛇毒(干毒，由安徽省黃山市屯溪毒蛇養(yǎng)殖研究所提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)用SD雄性大鼠24只(由皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，體質(zhì)量(250±15)g。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及方法 大鼠隨機(jī)分為3個組，即正常對照組、生理鹽水組和眼鏡蛇毒組，每組8只大鼠。眼鏡蛇毒組，將干粉狀眼鏡蛇毒與生理鹽水按1∶3比例稀釋后，于右大腿后外側(cè)按0.5 μl/kg量注入；生理鹽水組在同部位注入相同體積的生理鹽水；正常對照組不作處理。仔細(xì)觀察，若發(fā)現(xiàn)蛇毒組大鼠煩躁不安，呼吸急促伴嘯鳴音等中毒癥狀特別明顯時，立即腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)處死；同時處死另外兩組大鼠。斷頭，取右側(cè)第5腰神經(jīng)節(jié)，包埋成蠟塊后切片，厚5 μm，切片后脫蠟，依次進(jìn)行下面的步驟：3%雙氧水，室溫10 min，熱修復(fù)后冷卻，PBS洗3次，每次5 min；正常小牛血清封閉37℃1 h，PBS洗3次，每次5 min；滴加一抗BDNF(1∶150)、c-jun(1∶1 200)，冰箱4℃過夜，PBS洗3次，每次5 min；第2天生物素化羊抗兔IgG(1∶100)復(fù)溫1 h，鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC 1∶100)液1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片后，光鏡下仔細(xì)觀察分析片子。

1.4 神經(jīng)元計(jì)數(shù)及灰度值測定 在高倍視野下(×400)計(jì)數(shù)脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)BDNF和c-jun陽性神經(jīng)細(xì)胞，用Image J圖像分析軟件測量細(xì)胞平均灰度值。

2 結(jié)果

正常組、生理鹽水組及眼鏡蛇毒組大鼠的右側(cè)第5腰神經(jīng)節(jié)都有BDNF和c-jun表達(dá)，BDNF和c-jun陽性細(xì)胞都呈棕黃色，主要為胞漿著色，著色都較均勻(見圖1、2)，少量的細(xì)胞呈空泡樣；多數(shù)為大型細(xì)胞，也有中、小型細(xì)胞，其中BDNF陽性神經(jīng)元中大型細(xì)胞占總數(shù)70.7%，c-jun陽性神經(jīng)元中大型細(xì)胞占總數(shù)72.2%。右側(cè)第5腰神經(jīng)節(jié)生理鹽水組BDNF和c-jun平均灰度值和細(xì)胞數(shù)與正常對照組相比較均沒有差異(P>0.05)；右側(cè)第5腰神經(jīng)節(jié)眼鏡蛇毒組較正常對照組和生理鹽水組平均灰度值顯著降低(P<0.01)，細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.01，見表1)。

A：正常對照組；B：生理鹽水組；C：眼鏡蛇毒組圖1 在大鼠脊神經(jīng)節(jié)中BDNF表達(dá)的情況(HPF×400)Fig 1 Expression of BDNF in spinal ganglion of rats(HPF×400)

A：正常對照組；B：生理鹽水組；C：眼鏡蛇毒組圖2 在大鼠脊神經(jīng)節(jié)中c-jun表達(dá)的情況(HPF×400)Fig 2 Expression of c-jun in spinal ganglion of rats(HPF×400)

眼鏡蛇毒組與生理鹽水組和正常對照組比較：﹡P<0.01，生理鹽水組和正常對照組比較：#P>0.05

3 討論

脊神經(jīng)節(jié)是脊神經(jīng)傳入第一級神經(jīng)元胞體的位置，是機(jī)體內(nèi)外環(huán)境與脊髓中樞聯(lián)結(jié)的紐帶，是多種神經(jīng)肽的制造場所和輸送站。通過脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)肽向中樞和外周端的輸入和釋放，從而調(diào)節(jié)和傳遞機(jī)體各種感覺信息。外周神經(jīng)的損傷會影響神經(jīng)肽的合成、輸送和釋放，進(jìn)而影響脊神經(jīng)節(jié)的功能。在形態(tài)學(xué)上，脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞體直徑大于35 μm 為大型細(xì)胞,25～35 μm 為中型細(xì)胞,小于25 μm 為小型細(xì)胞[4]。本研究中觀察到的神經(jīng)元主要為大型細(xì)胞，BDNF陽性神經(jīng)元中大型細(xì)胞占總數(shù)70.7%，c-jun陽性神經(jīng)元中大型細(xì)胞占總數(shù)72.2%，這與大型神經(jīng)元主要在傳遞非傷害性感受和抑制傷害感受中起著重要作用相一致[5]。

在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育過程中，BDNF能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、生長和分化并維持其生理功能[6]。當(dāng)坐骨神經(jīng)切斷后，背根神經(jīng)節(jié)中BDNF表達(dá)增加[7]，Utley等在用BDNF注入膠原管治療坐骨神經(jīng)損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，BDNF有明顯的促神經(jīng)再生作用[8]，對脊神經(jīng)節(jié)損傷可能具有保護(hù)作用[9]。本實(shí)驗(yàn)蛇毒組BDNF的高表達(dá)，可能與眼鏡蛇毒中毒后BDNF對脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的修復(fù)和保護(hù)有關(guān)。有研究表明汞中毒后大鼠脊髓及脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)的膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)上調(diào)可加速BDNF的合成和分泌[10]，本實(shí)驗(yàn)蛇毒組脊神經(jīng)節(jié)BDNF的表達(dá)顯著上調(diào)是否與膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)水平上升有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

c-jun是即刻早基因之一，BDNF是c-jun的目的基因，即刻早基因可促進(jìn)BDNF的表達(dá)[11]。脊神經(jīng)節(jié)存在許多與傷害性刺激相關(guān)的神經(jīng)活性物質(zhì)[12]，如c-jun、c-fos等。c-jun在神經(jīng)細(xì)胞信息傳導(dǎo)中起著重要作用，普遍存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，在正常情況下表達(dá)較少。周圍神經(jīng)損傷后,神經(jīng)元在發(fā)生變性和再生的過程中，伴隨著神經(jīng)遞質(zhì)的變化，這可能是神經(jīng)細(xì)胞對傷害性刺激的反應(yīng)。有報(bào)導(dǎo)表明眼鏡蛇毒可顯著上調(diào)大鼠海馬CA1區(qū)c-fos和c-jun的表達(dá)[13]，在坐骨神經(jīng)病變情況下，腰4和腰5脊神經(jīng)節(jié)在所有損壞的感覺神經(jīng)元中c-jun有大量的表達(dá)[14]，說明c-jun可能與神經(jīng)損傷有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒組比正常對照組、生理鹽水組大鼠脊神經(jīng)節(jié)c-jun表達(dá)明顯增強(qiáng)，這可能是機(jī)體對中毒后的一種傷害性刺激性反應(yīng)。在周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到傷害性刺激后，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)再生反應(yīng)，并伴隨c-jun基因表達(dá)上調(diào)，提示c-jun在抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)受損細(xì)胞修復(fù)以及改善神經(jīng)細(xì)胞的存活等方面發(fā)揮重要作用[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)中眼鏡蛇毒組脊神經(jīng)節(jié)c-jun表達(dá)的增強(qiáng)，可能是機(jī)體對蛇毒所致神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制之一。

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