JAK2-STAT3信號(hào)通路在舒芬太尼預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠心肌保護(hù)效應(yīng)中的作用

高燕鳳，劉 翔，白 娟，袁 慧，景桂霞

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，陜西西安 710061； 2.江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院麻醉科，江蘇鹽城 224000)

自MURRY等[1]1986年首次報(bào)道了心肌缺血預(yù)適應(yīng)(ischemia preconditioning, IPC)現(xiàn)象，IPC仍是目前證實(shí)的最為有效的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。盡管缺血預(yù)處理在多種動(dòng)物模型和人離體心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中都獲得了良好效果，但受限于安全及不可操作性等問題，無法進(jìn)行嚴(yán)格的臨床實(shí)驗(yàn)，至今仍未發(fā)揮令人滿意的臨床效應(yīng)。近年來不少研究發(fā)現(xiàn)有些藥物，如阿片肽、腺苷、緩激肽等，也可以模擬缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)作用，即藥物預(yù)處理(PPC)，對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)效應(yīng)。舒芬太尼是人工合成阿片類藥物，鎮(zhèn)痛強(qiáng)度大，可以維持患者手術(shù)期間血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，已廣泛應(yīng)用于心臟外科手術(shù)。既往研究表明，舒芬太尼預(yù)處理可以模擬缺血預(yù)處理減輕心肌缺血再灌注損傷，但對(duì)其保護(hù)機(jī)制尚不清楚[2]。近年來Janus激酶2-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3(JAK2-STAT3)通路因在心臟疾病發(fā)病機(jī)制中的作用而倍受關(guān)注，其在缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮重要作用[3]，而該通路是否參與了舒芬太尼預(yù)處理減輕心肌缺血再灌注損傷，還有待進(jìn)一步研究。本研究通過觀察舒芬太尼預(yù)處理對(duì)血流動(dòng)力學(xué)、心肌酶、心肌梗死面積以及心肌組織磷酸化STAT3表達(dá)的影響，探討JAK2-STAT3信號(hào)通路在舒芬太尼預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠心肌保護(hù)效應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(陜2007-001)。

1.2心肌缺血再灌注模型的制備與分組大鼠術(shù)前禁食12 h，可自由飲水，腹腔注射200 g/L烏拉坦5 mL/kg 麻醉。將大鼠固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，呈仰臥位，四肢皮下連接電極，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部去毛消毒皮膚，行頸動(dòng)脈穿刺置管，監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓。行氣管切開插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，呼吸次數(shù)60～80次/min，6～7 mL/次，呼吸比1∶3，按照大鼠呼吸頻率及胸廓起伏程度調(diào)整呼吸參數(shù)。使用加熱毯將體溫維持在(37±1)℃。于左胸第3～5肋間打開大鼠胸腔后，剪開心包膜充分暴露心臟，找到左冠狀動(dòng)脈前降支，用6-0無損傷縫線穿過心臟表層，以橡皮筋墊底，雙線結(jié)扎前降支，造成心肌缺血30 min后，松開結(jié)扎線，恢復(fù)血流120 min。以心電圖顯示ST段抬高、QRS波變高變寬和心肌變?yōu)榍嘧仙珵榻Y(jié)扎成功的標(biāo)準(zhǔn)。

采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠分為5組(n=12)。假手術(shù)組(S組)只穿線，不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，持續(xù)150 min；缺血再灌注組(I/R組)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支缺血30 min，恢復(fù)灌注120 min；舒太尼預(yù)處理組(SPC組)：缺血前采用股靜脈泵注舒芬太尼(批號(hào)060337，DGSWRodleben公司，德國(guó))1 μg/kg，泵注5 min，間隔5 min，重復(fù)處理3次，總量共3 μg/kg，缺血30 min，恢復(fù)灌注120 min；舒芬太尼預(yù)處理聯(lián)合JAK2激酶抑制劑組(S+A組)在舒芬太尼預(yù)處理前5 min給予JAK2激酶抑制劑AG490(1 mg/kg)，缺血前30 min給予舒芬太尼預(yù)處理，缺血30 min，恢復(fù)灌注120 min；JAK2激酶抑制劑組(A組)則缺血前35 min給予JAK2激酶抑制劑AG490(1 mg/kg)，缺血30 min，恢復(fù)灌注120 min。除S+A組，其余各組大鼠缺血前經(jīng)股靜脈泵注與舒芬太尼溶劑和抑制劑溶劑等量的生理鹽水，分別為0.5 mL和0.3 mL。

1.3血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)于心肌缺血前30 min(T0)、缺血前即刻(T1)、缺血30 min(T2)、再灌注30 min(T3)和再灌注120 min(T4)時(shí)記錄各組大鼠心率(HR)和平均動(dòng)脈壓(MAP)。

1.4血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)濃度的測(cè)定于大鼠再灌注120 min時(shí)，快速解剖大鼠腹腔，取腹主動(dòng)脈血3 mL，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液分裝，-80 ℃ 保存。ELISA法測(cè)定血清CK-MB和LDH活性。

1.5心肌梗死面積的測(cè)定除假手術(shù)組(即A組)外，各組取6只大鼠，于心肌缺血再灌注末，再次結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，從主動(dòng)脈內(nèi)注入50 g/L伊文氏藍(lán)1 mL，非缺血區(qū)心肌呈深藍(lán)色。剪取心臟，濾紙吸干后分離出左心室，置-20 ℃冰箱備用。將速凍后的心臟從心尖到心基部平行于房室溝方向?qū)⑿呐K切成5～6片，厚約2 mm。置于2 mL 1%氧化三苯基四氨唑(pH 7.4)中，在37 ℃孵育20 min，置于100 mL/L甲醛溶液中固定15 min，拍照，紅色為危險(xiǎn)區(qū)，白色為梗死區(qū)。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics公司，美國(guó))測(cè)量危險(xiǎn)區(qū)(area at risk, AAR)和梗死區(qū)(infarct size, IS)的面積，并以心肌重量校正心肌組織缺血危險(xiǎn)區(qū)和梗死區(qū)面積。各心肌切片與心肌重量乘積的總和為左室面積(LV)。心肌梗死面積(IS)為每一片心肌梗死面積與心肌重量乘積的總和；心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)范圍(AAR)為每一片心肌缺血區(qū)域面積與心肌重量乘積的總和。心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)范圍用AAR與LV比值(AAR/LV，%)表示，心肌梗死的嚴(yán)重程度以IS與AAR比值 (IS/AAR，%)表示。

1.6Westernblot法檢測(cè)心肌磷酸化STAT3(P-STAT3)的表達(dá)取100 mg心肌組織，用1 mL RIPA裂解液+蛋白酶抑制劑PMSF提取心肌總蛋白，核蛋白提取參考試劑盒說明。然后用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取80 μg蛋白樣品加入5×上樣緩沖液加熱煮沸5 min，樣品變性后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(100 g/L分離膠，30 g/L濃縮膠)分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入1∶800稀釋的兔抗P-STAT3抗體

(Cell Signaling公司，美國(guó))，4 ℃孵育過夜；TBST 3×10 min洗膜后，分別加入1∶4 000稀釋的兔源二抗(Santa Cruz公司，美國(guó))，室溫孵育2 h；再次TBST 3×10 min洗膜，用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，Quantity One凝膠分析軟件分析圖像，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)各組HR之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與T0時(shí)相比，除S組外，其余各組T2～T4時(shí)MAP降低(P<0.05)；與S組相比，其余各組T2～T4時(shí)MAP降低(P<0.05或P<0.01)；T2～T4時(shí)SPC組MAP數(shù)值較I/R組稍高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1、表1)。

圖1各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心率(次/min)變化

Fig.1 HR changes at different time points in each group

表1各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)MAP變化

與T0比較，#P<0.05；與S組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2血清CK-MB和LDH活性與S組相比，其余各組大鼠血清CK-MB和LDH活性明顯增高(P<0.01)；與I/R組相比，SPC組CK-MB和LDH活性降低(P<0.01，圖2)。

圖2各組大鼠心肌缺血再灌注后CK-MB和LDH的變化

Fig.2 CK-MB and LDH changes after myocardial ischemia-reperfusion in each group

與S組比較，**P<0.01；與I/R組比較，##P<0.01。

2.3心肌梗死面積測(cè)定各組大鼠心肌缺血范圍差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SPC組心肌梗死范圍小于I/R組(P<0.01)，I/R組、S+A組和A組之間心肌梗死范圍差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2各組大鼠心肌梗死范圍比較

與I/R組比較，##P<0.01。

2.4心肌組織磷酸化STAT3表達(dá)與S組比較，I/R組和SPC組P-STAT3表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，S+A組和A組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SPC組P-STAT3表達(dá)上調(diào)高于I/R組(P<0.01，圖3)。

3 討 論

研究心肌缺血再灌注時(shí)常采用全心缺血再灌注模型和左心室局部心肌缺血再灌注模型，制備左心室局部心肌缺血再灌注模型時(shí)多采用阻斷冠狀動(dòng)脈左前降支實(shí)現(xiàn)[4]。由于大鼠冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)少，模型制備成功率高，可重復(fù)性好，左心室局部心肌缺血再灌注模型被認(rèn)為是制備心肌缺血再灌注的首選模型。本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注組血清CK-MB和LDH活性增高，缺血危險(xiǎn)區(qū)占左室的50%左右，梗死區(qū)占缺血危險(xiǎn)區(qū)的46%左右，表明大鼠在體心肌缺血再灌注模型制備成功。

圖3各組大鼠心肌組織磷酸化STAT3表達(dá)水平比較

Fig.3 Comparison of myocardial phosphorylated STAT3 expression of rats in different groups

與S組比較，**P<0.01；與I/R組比較，##P<0.01。

既往研究表明缺血前給予舒芬太尼間隔5 min，重復(fù)處理3次同樣能夠減少心肌缺血再灌注損傷[5-6]。臨床中采用舒芬太尼8～50 μg/kg大劑量維持心血管等大型手術(shù)；復(fù)合麻醉中如“快通道”心臟麻醉手術(shù)中舒芬太尼的誘導(dǎo)劑量為1～4 μg/kg[7]；普外手術(shù)中常給予舒芬太尼0.1～2 μg/kg誘導(dǎo)插管。本實(shí)驗(yàn)參照臨床手術(shù)中舒芬太尼的最小誘導(dǎo)劑量0.1～2 μg/kg和藥理研究中劑量的選擇方法，并根據(jù)人與大鼠藥物等效劑量換算公式，模擬既往實(shí)驗(yàn)中舒芬太尼預(yù)處理方式，選擇缺血前泵注舒芬太尼(1 μg/kg)5 min，間隔5 min，反復(fù)處理3次，總量3 μg/kg的預(yù)處理方式。本研究依據(jù)文獻(xiàn)[8]，選擇JAK2激酶抑制劑AG490的給藥時(shí)間、給藥劑量及給藥途徑。

CK-MB和LDH的心肌特異性高，分子質(zhì)量大，半衰期長(zhǎng)，是判斷心肌損傷的常用生化指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，缺血再灌注后心肌細(xì)胞損傷導(dǎo)致大量心肌酶釋放入血，血清CK-MB和LDH活性明顯增高；給予舒芬太尼預(yù)處理后，血清中CK-MB和LDH活性明顯降低，表明舒芬太尼能夠減少缺血再灌注引發(fā)的心肌細(xì)胞損傷，產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。此外，減少心肌梗死面積是衡量一種保護(hù)措施有效的金指標(biāo)，既往大量實(shí)驗(yàn)都采用此指標(biāo)。本研究采用Even’S Blue-TTC染色法測(cè)定再灌注120 min后心肌梗死面積，嚴(yán)格按照心電圖和心肌顏色變化判斷冠脈是否恢復(fù)灌注，結(jié)果顯示舒芬太尼預(yù)處理組心肌梗死范圍明顯較缺血再灌注組減少，提示可減少缺血再灌注損傷。

JAK-STAT通路主要由JAKs蛋白家族和STATs蛋白家族組成，其中JAK是STAT的上游共有激酶，接受細(xì)胞外細(xì)胞因子的信號(hào)刺激并通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)化為各種生物反應(yīng)，JAK-STAT通路廣泛參與了細(xì)胞應(yīng)激、生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等。有研究表明，心肌組織在缺血再灌注的損傷后可誘發(fā)多種細(xì)胞炎性介質(zhì)及因子的產(chǎn)生，可進(jìn)一步激活JAK2，啟動(dòng)JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使STAT3磷酸化并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)目的基因進(jìn)一步表達(dá)，轉(zhuǎn)錄合成Bcl-2等多種抗凋亡蛋白發(fā)揮心肌保護(hù)作用[9]。STAT3是JAK2的靶蛋白，通常情況下存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在JAK2被活化后，信號(hào)通過JAK2/STAT3通路傳導(dǎo)，使STAT3磷酸化而被激活，使P-STAT3表達(dá)增強(qiáng)，然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)目的基因的進(jìn)一步表達(dá)，通過轉(zhuǎn)錄合成多種效應(yīng)蛋白發(fā)揮作用。既往研究證實(shí)JAK2- STAT3信號(hào)通路在缺血預(yù)處理和多種藥物預(yù)處理中發(fā)揮了重要作用[10-13]。本研究發(fā)現(xiàn)舒芬太尼預(yù)處理組和缺血再灌注組心肌磷酸化STAT3表達(dá)水平均較假手術(shù)組明顯增加；與缺血再灌注組相比，舒芬太尼預(yù)處理組磷酸化STAT3表達(dá)水平增加更為顯著，且兩者之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在舒芬太尼預(yù)處理前給予JAK2激酶抑制劑AG490 1 mg/kg后，心肌組織磷酸化STAT3表達(dá)水平下調(diào)，舒芬太尼的心肌保護(hù)效應(yīng)也被抑制；單獨(dú)應(yīng)用AG490，心肌磷酸化STAT3表達(dá)水平與假手術(shù)組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)心肌缺血再灌注損傷沒有影響。這表明舒芬太尼預(yù)處理可能通過上調(diào)磷酸化STAT3的表達(dá)，產(chǎn)生了心肌保護(hù)作用，單獨(dú)應(yīng)用AG490未增加缺血再灌注損傷。

JAK2-STAT3信號(hào)通路通過下游眾多靶點(diǎn)發(fā)揮作用，如GSK-3β、mTOR、NF-κB、eNOS以及Bcl-2家族等[14]。缺血預(yù)處理可以激活JAK2-STAT3通路，上調(diào)24 h后COX-2及iNOS等保護(hù)蛋白，發(fā)揮延期保護(hù)作用[10]。舒芬太尼預(yù)處理激活JAK2-STAT3信號(hào)通路的下游具體保護(hù)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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