尿激酶減輕草酸誘導(dǎo)的MDCK細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷的實(shí)驗(yàn)研究

明 星，朱 嬌，辛文虎，岳中瑾

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，甘肅蘭州 730030；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，陜西西安 710061)

腎結(jié)石是泌尿系統(tǒng)疾病中的常見病、多發(fā)病，以草酸鈣(CaOxa)結(jié)石多見。一般認(rèn)為，腎結(jié)石的形成是一系列生理的、化學(xué)的、生化的及分子調(diào)節(jié)等因素共同作用的結(jié)果[1]。腎小管上皮細(xì)胞受損被認(rèn)為是促進(jìn)CaOxa結(jié)石形成的重要誘因[2]。尿液中草酸含量增高被認(rèn)為是促進(jìn)結(jié)石形成的一個(gè)重要原因[3]。草酸作為尿液中一種物質(zhì)，當(dāng)其過飽和時(shí)，可通過產(chǎn)生氧自由基等多種途徑損傷腎小管上皮細(xì)胞，細(xì)胞受損后，基底膜直接暴露于尿液環(huán)境中，有利于微晶體的滯留，為晶體成核提供了有效位點(diǎn)；同時(shí)，損傷的細(xì)胞膜增加了晶體的粘附，甚至阻塞腎小管，造成腎小管細(xì)胞發(fā)生適應(yīng)性改變，影響結(jié)晶粘附與聚集[4]。草酸與腎小管上皮細(xì)胞之間的相互作用是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，大量的分子和活性蛋白參與，其中包括腎小管上皮細(xì)胞分泌的尿激酶(UK)。然而對于UK在結(jié)石形成過程中是否有促進(jìn)或者抑制的作用，尚缺乏細(xì)胞及分子水平的研究。我們采用原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，研究UK能否減輕草酸對體外培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞造成的脂質(zhì)過氧化損傷及細(xì)胞表面結(jié)晶的粘附與聚集，探討UK在尿路結(jié)石防治中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株及試劑正常狗的腎小管上皮細(xì)胞株MDCK(蘭州大學(xué)泌尿研究所提供)；培養(yǎng)液DMEM-F12(HyClone，美國)；新生牛血清(Gibco,美國)；青霉素(華北制藥股份有限公司)；鏈霉素(大連美羅大藥廠)；丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；乳酸脫氫酶(1actate dehydro-genase，LDH)測試盒(美國GBD公司)；細(xì)胞增生分析試劑盒(CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所)；尿激酶(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠)；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.2主要儀器Forma CO2孵箱(HW0301T-VBA型，F(xiàn)orma Scientific，USA)；醫(yī)用超凈工作臺(YG-875型，蘇州長橋凈化設(shè)備廠)；倒置熒光顯微鏡(IXSI，奧林巴斯公司)；電熱恒溫水浴箱(DK-600型，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) MDCK用含100 mL/L新生牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)加入100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素，培養(yǎng)條件為37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度。MDCK傳代采用胰蛋白酶消化法，細(xì)胞達(dá)90%融合后用D-Hanks平衡液洗滌2次，加入1 mL 2.5 g/L胰酶消化液,輕輕搖動培養(yǎng)瓶，置37 ℃孵育箱，2～3 min，在倒置顯微鏡下觀察消化程度。當(dāng)細(xì)胞變圓、細(xì)胞之間出現(xiàn)孔隙且不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度,中止消化。加入100 mL/L新生牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞脫離瓶壁并形成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液分別分裝入12孔板中，每孔3 mL，置孵育箱(37 ℃、50 mL/L CO2)內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.2MDA及LDH含量的檢測 將MDCK懸液接種于12孔板中，每孔3 mL，孵育24 h后加入無血清的DMEM-F12孵育12 h，使細(xì)胞同步化。將孔板上的細(xì)胞分為3組，空白組只加入無血清培養(yǎng)液；對照組在無血清培養(yǎng)基中同時(shí)加入5 mmol/L的草酸；尿激酶組在無血清培養(yǎng)基中同時(shí)加入5 mmol/L的草酸和10萬U的UK。培育2 h后將細(xì)胞懸浮液移入EP管內(nèi)，在4 ℃離心10 min取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，測定MDA和LDH的含量。

1.3.4細(xì)胞損傷的檢測 采用CCK-8法檢測各組對細(xì)胞增殖的抑制作用，細(xì)胞分組同上。將MDCK細(xì)胞懸液按1×107個(gè)/mL、0.1 mL/孔接種于96孔板，作用一定時(shí)間(0.5、1、1.5、2 h)，更換無血清培養(yǎng)液，每孔加入10 μL的CCK-8，37 ℃孵育4 h后，檢測細(xì)胞活性，以細(xì)胞活性反映細(xì)胞的損傷程度。用酶標(biāo)儀在450 nm處測量上述細(xì)胞A值，各個(gè)條件下的細(xì)胞平行測定3個(gè)復(fù)孔，求A值的平均值。細(xì)胞活性=A(實(shí)驗(yàn)組)/A(對照組)×100。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞的生長情況各組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，均于24～36 h開始貼壁，48～72 h后開始生長，96 h后呈指數(shù)性增長，120 h左右基本鋪滿孔板。

2.2細(xì)胞表面的晶體粘附情況實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2 h后，在倒置顯微鏡下觀察到各組細(xì)胞表面有不同程度的晶體粘附(圖1)?？瞻捉M細(xì)胞生長相對良好，未見細(xì)胞腫脹，表面未見晶體形成。草酸組可見細(xì)胞腫脹，失去原有的細(xì)胞形態(tài)，變成類橢圓形或不規(guī)則形狀，部分出現(xiàn)破裂，胞核模糊，胞質(zhì)溶解消失，可見大量晶體粘附于細(xì)胞表面。尿激酶組形態(tài)和草酸組基本相同，但細(xì)胞損傷程度明顯減輕，細(xì)胞死亡減少，細(xì)胞表面晶體粘附明顯減少。

2.2LDH及MDA含量的測定結(jié)果實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2 h后，測定各組培養(yǎng)基中LDH及MDA含量，結(jié)果見表1。各組數(shù)據(jù)結(jié)果比較顯示：①草酸組和UK組細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH及MDA含量均明顯升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；②與UK組相比，草酸組細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH及MDA含量更高，兩者之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1實(shí)驗(yàn)2h后各組細(xì)胞培養(yǎng)基中MDA及LDH含量的比較

Tab.1 Content of MDA and LDH in culture media 2 h after the experiment

(mmol/mL,

與對照組比較，△P<0.05；與草酸組比較，*P<0.05。

圖1實(shí)驗(yàn)2h后草酸鈣晶體不同程度粘附于各組細(xì)胞表面

Fig.1 Calcium oxalate crystals adhering to each cell surface 2 h after the experiment(×200)

A：空白組；B：草酸組；C：尿激酶組。

2.3細(xì)胞活力的測定通過檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞活力，確定各組細(xì)胞的損傷程度。隨著時(shí)間的推移，各組細(xì)胞的活力均有所下降，UK組相對于草酸組細(xì)胞活力下降相對緩慢，1 h后草酸組細(xì)胞活力下降到(46.2±3.4)%，并逐漸趨于平穩(wěn)(圖2)。

3 討 論

腎結(jié)石的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。腎小管上皮細(xì)胞損傷學(xué)說一直是被研究的熱點(diǎn)，該學(xué)說認(rèn)為體內(nèi)活性氧增多，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，腎小管上皮細(xì)胞損傷，成石物質(zhì)的粘附與聚集，最終形成結(jié)石[5]。正常細(xì)胞之間的緊密連接有利于信號傳導(dǎo)和抵御不利因素，細(xì)胞受損后，膜喪失極性，磷脂失去非對稱性[6]，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞間的緊密連接消失，細(xì)胞防御機(jī)制被破壞，從而有利于晶體在細(xì)胞表面的成核和生長。機(jī)體內(nèi)，腎小管上皮細(xì)胞病理情況下能夠產(chǎn)生大量氧自由基，氧自由基對生物膜的主要成分磷脂中不飽和脂肪酸的不飽和鍵具有很高的親和力，從而產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。本研究中采用狗腎小管上皮細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)最終確立了草酸(5 mmol/L)和尿激酶(UK，10萬U)的最佳濃度。

圖2各組MDCK在作用不同時(shí)間后細(xì)胞活力的變化

P<0.05vs. 0 h。

草酸和腎結(jié)石的關(guān)系密切，可促進(jìn)自由基的生成，引發(fā)生物膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，甚至滲入細(xì)胞內(nèi)部，破壞線粒體和DNA結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞壞死和凋亡[7]。草酸經(jīng)腎臟的排泄時(shí)，腎小管內(nèi)草酸濃度增加了10～50倍，高濃度的草酸對腎小管上皮細(xì)胞具有直接的毒性作用，使細(xì)胞產(chǎn)生氧化性損傷，可造成腎小管上皮細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，引起腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和壞死，產(chǎn)生的細(xì)胞碎片促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶的核化和聚集。有研究表明，腎小管上皮細(xì)胞損傷后，COM晶體的粘附最大可增加20倍[8]。本研究經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，認(rèn)為5 mmol/L的草酸為最適損傷濃度。研究結(jié)果顯示，草酸組對MDCK細(xì)胞的損傷比較明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖受到影響，細(xì)胞活力下降，標(biāo)志細(xì)胞損傷的LDH和反映脂質(zhì)過氧化反應(yīng)水平的MDA的釋放量都顯著提高，細(xì)胞變得皺縮、表面粗糙，部分細(xì)胞脫落，脫落的細(xì)胞碎片成為CaOxa晶體成核的理想基質(zhì)，細(xì)胞表面晶體粘附及聚集顯著。

UK是一種主要由腎臟細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，能降解纖維蛋白凝塊、血循環(huán)中的纖維蛋白原凝血因子V和凝血因子Ⅷ，抑制血小板聚集，因此常用于急性發(fā)作的血栓性疾病的治療。早期有研究證明,尿激酶在腎結(jié)石形成過程中起重要的作用，生理狀態(tài)下可以抑制腎結(jié)石的形成，當(dāng)其濃度降低時(shí)，可能促進(jìn)腎結(jié)石形成[9]；近年來主要通過基因多態(tài)性的方法研究尿激酶與結(jié)石的關(guān)系。TSAI等[10]用單核苷酸多態(tài)性作為工具證明尿激酶3’-UTRT等位基因與結(jié)石形成有很高的相關(guān)性。我們前期研究表明，腎結(jié)石患者血清中UK含量較健康人群低，因此在本實(shí)驗(yàn)中，我們于細(xì)胞液中加入U(xiǎn)K。結(jié)果顯示，相對于UK組MDCK細(xì)胞損傷相對較輕，細(xì)胞活性下降幅度降低；LDH及MDA含量升高幅度不及草酸組；細(xì)胞表面晶體粘附及聚集也不及草酸組顯著。這表明外源性UK能夠減輕草酸對腎小管上皮細(xì)胞的損傷作用，防止晶體的聚集。

腎小管上皮細(xì)胞損傷是腎結(jié)石形成的重要前提。尿液中高濃度的草酸能夠損傷腎小管上皮細(xì)胞，而腎臟所分泌的尿激酶能減輕草酸對腎小管上皮細(xì)胞的損傷, 降低晶體在細(xì)胞表面的粘附與聚集。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測UK可能通過抑制草酸引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而減輕腎小管上皮細(xì)胞的損傷。因此，增加腎臟以及尿液中UK的濃度，有助于腎結(jié)石的防治，為腎結(jié)石的治療提供了一條新的思路。然而如何提高UK的濃度及UK和草酸的相互作用，本研究尚未涉及，今后將重點(diǎn)研究。

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