匹配HLA位點對腎移植術(shù)后長期存活的影響

鄭 瑾，薛武軍，何曉麗，侯 軍，田曉輝，任 莉

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病醫(yī)院腎移植科，陜西西安 710061)

人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)是HLA基因復(fù)合體所編碼的產(chǎn)物，HLA基因復(fù)合體位于第6號染色體的短臂上，調(diào)節(jié)人體免疫反應(yīng)和異體移植排斥反應(yīng)。HLA基因復(fù)合體是目前所知的最高度多態(tài)性的遺傳系統(tǒng)，在抗原識別、提呈、免疫應(yīng)答和調(diào)控等方面起重要作用，是導(dǎo)致同種異體移植排斥反應(yīng)的主要抗原，也被稱之為移植抗原[1]。目前認為與移植有關(guān)的主要HLA抗原有HLA-A、B、DR抗原[2]。

HLA抗原與同種異體移植的排斥反應(yīng)密切相關(guān)。受體與供體組織各具有不同的HLA抗原，若受體接受了不同HLA抗原的供體器官就可能引起免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體，從而誘發(fā)排斥反應(yīng)。HLA分型技術(shù)常應(yīng)用于器官移植時供受者組織相容性的配型。HLA配型(即組織相容性試驗)程度是影響移植效果(排斥反應(yīng)發(fā)生)、決定器官的分配的重要因素。隨著環(huán)孢素A(CsA)、普樂可復(fù)(FK506)、馬替麥考酚酯(MMF)等強效免疫抑制藥物的應(yīng)用，排斥反應(yīng)明顯減少和減輕，移植效果得到改善，使選擇相容性高的供者一度被認為并不十分重要。然而OPELZ等[3]對近10萬例腎移植臨床隨訪資料的研究分析表明，理想的HLA配型，特別是DR位點的相配，可以提高移植腎存活率10%～30%，而且對再次移植和高?；颊叩囊浦残Ч用黠@。

國外有研究報道，有些HLA抗原對移植效果具有重要影響，而有些抗原的影響并不十分重要，同樣是供受者的HLA錯配，有些錯配明顯影響存活率，而有些錯配并無明顯影響，甚至有益。因而提出HLA配型存在“有害錯配、有益錯配、中性錯配”根據(jù)這一觀念。本課題通過分析供受者匹配HLA位點分布頻率與腎移植術(shù)后長期存活之間的關(guān)系，以揭示匹配HLA位點對移植效果的不同影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料選取西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病醫(yī)院自1992年1月至2002年12月749例腎移植術(shù)后患者。根據(jù)術(shù)后存活時間分為兩組：存活10年以上組和存活10年以下組，術(shù)后均采用CsA/FK506+MMF+Pred免疫抑制方案。比較分析術(shù)后兩組患者HLA匹配位點分布頻率的差異。

1.2方法

1.2.1HLA血清學(xué)分型技術(shù) 取出-80 ℃保存的Terasaki單克隆抗體Ⅰ類或者Ⅱ類干板，放置室溫15 min。每孔加5 μL礦物油。取淋巴細胞加入72孔血清板，每孔加1 μL T淋巴細胞(Ⅰ類)或B淋巴細胞(Ⅱ類)，細胞含量為2×106/mL(2 000個細胞/孔)，(22±2)℃作用30 min。然后每孔加1 μL溶解的補體并混勻，(22±2)℃作用60 min。最后，每孔加5 μL 0.5 g/L曙紅，5 min后加5 μL 1.2 g/L甲醛溶液，用泰薩奇密封板或玻璃片密封試劑板。

1.2.2結(jié)果觀察 使用相差倒置顯微鏡觀察，死亡細胞由于曙紅進入細胞體內(nèi)而呈紅色，無折光性，細胞腫脹，體積增大；存活淋巴細胞因不被著色而明亮，具有很強的折光性，容易鑒別。結(jié)果判定：陽性對照死亡細胞應(yīng)大于80%，陰性對照死亡細胞小于2%。按照NIH計分標(biāo)準(zhǔn)，以標(biāo)準(zhǔn)陽性、陰性對照為基礎(chǔ)計分，根據(jù)細胞死亡數(shù)的百分比判斷反應(yīng)結(jié)果(表1)。根據(jù)Terasaki HLA Ⅰ類(圖1)及Ⅱ類(圖2)抗原讀板紙進行HLA分型。

表1NIH計分標(biāo)準(zhǔn)

Tab.1 The NIH scoring criteria

死細胞記分意義0未試驗或無法讀數(shù)0～10%1陰性11%～20%2陰性可疑21%～40%4陽性可疑41%～80%6陽性反應(yīng)

圖1TerasakiHLAⅠ類抗原讀板紙

Fig.1 Read paper of Terasaki HLA classⅠ

圖2TerasakiHLAⅡ類抗原讀板紙

Fig.2 Read paper of Terasaki HLA class Ⅱ

2 結(jié) 果

2.1腎移植術(shù)后患者的一般情況我院自1992年1月至2002年12月行腎移植術(shù)后患者749例，存活10年以上腎移植術(shù)后患者490例，其中男性352例，女性184例，平均年齡(36±6.5)歲。原發(fā)病包括慢性腎小球腎炎、高血壓腎病、膜性腎病、IgA腎病等。術(shù)前416例行血液透析，血液透析時間1～36個月。69例行腹膜透析3～20個月(表2)。供、受者HLA-A、B、DR配型5個抗原錯配者5例，4個抗原錯配9例，3個抗原錯配210例，2個抗原錯配202例，1個抗原錯配51例，0個抗原錯配13例(表3)。存活10年以下腎移植術(shù)后患者259例，其中男性184例，女性75例，平均年齡(37±6.5)歲。術(shù)前221例行血液透析，血液透析時間1～36個月。36例行腹膜透析3～20個月(表2)。供、受者HLA-A、B、DR配型5個抗原錯配者4例，4個抗原錯配6例，3個抗原錯配117例，2個抗原錯配101例，1個抗原錯配26例，0個抗原錯配5例(表3)。全部供受者淋巴毒交叉配型(CDC)試驗陰性。供腎熱缺血時間5～12 min，冷缺血時間2～18 h。存活10年以上腎移植術(shù)后患者與存活10年以下患者的一般情況相比，各項指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)差異。

表2腎移植術(shù)后患者一般資料的比較

Tab.2 Comparison of patients’ general data after kidney transplantation

臨床資料存活10年以上患者存活10年以下患者P平均年齡(歲)36±6.537±7.5性別[n(%)] 男352(71.84)184(71.04)0.78 女138(28.16)75(28.96)0.84原發(fā)病[n(%)] 慢性腎小球腎炎455(92.86)236(91.12)0.77 高血壓病腎病10(2.04)7(2.70) 糖尿病腎病9(1.83)6(2.32) 多囊腎7(1.43)5(1.93) 其他9(1.84)6(2.32)透析 血液透析[n(%)]416(84.90)221(85.32)0.85 腹膜透析[n(%)]69(14.08)36(13.90) 未透析[n(%)]5(1.00)2(0.77)缺血 熱缺血(min)5～125～12 冷缺血(h)2～182～18

表3組織配型結(jié)果

Tab.3 Results of HLA mismatch

[n(%)]

2.2抗原類型對移植效果的影響對正常人群中HLA位點的抗原頻率分析表明，A2、A9、A11、B13、B35、B46、DR4和DR9比較常見。對目前存活的490例存活10年以上腎移植術(shù)后受者的抗原頻率分析發(fā)現(xiàn)，A2位點抗原在腎移植術(shù)后存活10年以上患者供受者匹配抗原出現(xiàn)頻率為18.35%，明顯高于腎移植術(shù)后存活10年以下的患者(9.60%)及正常人群(9.73%)(P<0.05)；HLA B位點抗原B5、B35在移植術(shù)后存活10年以上患者匹配HLA頻率高，分別是3.21% 和4.59%，顯著高于存活10年以下組(1.74%，3.48%)及正常人群(1.97%，3.46%)(P<0.05)；而B13、B46抗原在移植術(shù)后存活10年以下患者匹配HLA頻率高，分別是4.74%和5.03%，顯著高于存活10年以上組(2.75%，3.66%)(P<0.05)，與正常人群無統(tǒng)計學(xué)差異。DR9抗原在存活10年以上組的頻率為(11.93%)，顯著高于存活10年以下組(5.71%)和正常人群(6.54%)(P<0.05，圖3)。

圖3匹配位點分布頻率的比較

Fig.3 Comparison of the distribution frequency of matching locus

A：匹配HLA A位點抗原分布頻率；B：匹配HLA B位點抗原分布頻率；C：匹配HLA DR位點抗原分布頻率。與存活10年以下組及健康人群相比，*P<0.05。

3 討 論

器官移植學(xué)科的科學(xué)研究與臨床工作的終極目標(biāo)都是移植物有功能的長期存活。長期以來，選擇HLA相容的供體器官是提高移植物長期存活的主要措施之一。自1954年美國哈佛大學(xué)MERRIL等首次成功完成同卵雙生子間的腎臟移植開始，伴隨著組織相容性抗原的研究進展，人們逐漸認識到HLA相容性在組織器官移植中的重要性，使HLA復(fù)合體的基礎(chǔ)研究和組織配型技術(shù)在臨床器官移植中的應(yīng)用得到了廣泛的重視[4]。但是，自80年代起，由于環(huán)孢素A(CsA)的臨床應(yīng)用，器官移植的存活率顯著提高，HLA配型的臨床應(yīng)用價值也因此受到了人們的質(zhì)疑[5]。近年來，隨著臨床上器官移植隨訪資料的積累，HLA配型在器官移植中的重要意義又重新得到人們的公認[5-6]。盡管有其他因素的影響，HLA配型在器官移植中是十分必要的, 供受者HLA的相容程度依舊是影響移植效果和移植物長期存活的主要因素之一[7]。

目前，對于不同HLA抗原類型對腎移植效果的影響有不同看法。有一種意見，HLA-Ⅱ類抗原對移植腎長期存活意義較大。但也有學(xué)者認為HLA-Ⅱ類抗原只對移植3個月后的移植效果有重要影響，而HLA- I類抗原則對近期和遠期效果均有重要作用。有研究報道，一些HLA抗原對器官移植效果具有重要影響，而有些抗原影響并不十分重要[8]。同樣是供受者的HLA抗原錯配，有些錯配對受者存活率有明顯影響，而有些錯配并無影響，甚至有益。因而，有學(xué)者提出HLA配型中存在“有害錯配、有益錯配、中性錯配”的觀點[9-10]。根據(jù)這一觀念，本研究分析了HLA抗原類型對移植效果的不同影響，對腎移植術(shù)后患者匹配HLA位點分布頻率的分析發(fā)現(xiàn)，A2、B5、B35和DR9在存活10年以上組的頻率顯著高于存活10年以下組(P<0.05)；而B13、B46抗原在移植術(shù)后存活10年以下患者匹配HLA頻率高，顯著高于存活10年以上組(P<0.05)。由此推斷，供受者HLA-A2、B5、B35和DR9抗原相容的移植，可能有益于腎移植受者的長期存活；而B13、B46抗原相容的移植，是腎移植受者的長期存活的不利因素。

由于本研究選取1992年至2002年病例，當(dāng)時的HLA分型為血清學(xué)分型方法，和現(xiàn)在的HLA PCR-SSP法、PCR-SSO法及測序法相比，存在很多不足之處。本研究共選取病例749例，分為存活10年以上組(490)和存活10年以下組(259)，病例數(shù)相對不足。因此，關(guān)于匹配HLA和腎移植術(shù)后長期存活之間關(guān)系的確切定論還有待于大樣本的長期觀察研究。

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