重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Twist的構(gòu)建、表達及其對SKOV3細胞克隆形成能力的影響

尉春艷，張 熙，孫學軍，彭慧霞，史玉霞，王桂賢

(西安交通大學醫(yī)學院：1.第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004； 2.第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710004；3.第一附屬醫(yī)院普外科，陜西西安 710061)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，早期癥狀不明顯，很多患者診斷時已至晚期，而且極易復發(fā)轉(zhuǎn)移、死亡率很高。卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲機制不清。近年的研究發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)與包括卵巢癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在EMT 過程中細胞間的連接丟失，細胞活動能力增加，并擁有間質(zhì)細胞的特征，是惡性腫瘤細胞獲得轉(zhuǎn)移侵襲能力過程中的重要事件[1]。Twist基因編碼的蛋白在EMT過程中具有重要作用。本研究通過構(gòu)建含有Twist基因的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Twist，為進一步研究上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑Twist cDNA序列合成(609 bp)、Twist上下游引物(上海生工)；EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA連接酶、DNA膠回收試劑盒(TaKaRa)；pEGFP-N1載體(美國Clontech公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen)；SKOV3細胞系為西安交通大學醫(yī)學院中心實驗室保存；Trizol(Invitrogen);Real-time PCR試劑盒(北京全式金公司)；鼠抗人Twist(Santa)、鼠抗人β-actin(Sigma)。

1.2Twist過表達載體即重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Twist的構(gòu)建在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找出human Twist cDNA序列，并生物合成。按以下體系配制退火反應體系：正義寡核苷酸(100 μmol/L)5 μL，反義寡核苷酸(100 μmol/L)5 μL，NaCl 100 mmol/L，Tris-Cl pH 7.4 50 mmol/L，總反應體系50 μL。按以下程序：90 ℃ 4 min，70 ℃ 10 min，55 ℃ 10 min，40 ℃ 10 min，25 ℃ 10 min退火。按如下反應條件雙酶切載體：10×緩沖液2 μL，pLentilox 3.7 1 μL，EcoRⅠ 1 μL，BamHⅠ 1 μL，ddH2O 15 μL，37 ℃酶切3 h。酶切產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳分離后用膠回收試劑盒純化。將純化的質(zhì)粒濃度調(diào)整為0.5 μg/μL，按照以下體系配制連接反應體系：T4 DNA連接酶 1 μL，線性化載體1 μL，退火寡核苷酸3 μL，10×連接酶Buffer 1 μL，加水補足10 μL，16 ℃酶連接16 h。在氨芐抗性的固態(tài)培養(yǎng)基平板上37 ℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的DH5α感受態(tài)細胞，挑取其多個菌落至氨芐抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后進行測序鑒定。

1.3Twist轉(zhuǎn)染SKOV3細胞株按Invitrogen公司的LipofectamineTM2000試劑盒說明書，將pEGFP-N1-Twist轉(zhuǎn)染入SKOV3細胞系：SKOV3轉(zhuǎn)染前24 h接種于6孔培養(yǎng)板，純化的重組質(zhì)粒4 μg，12 μL LipofectamineTM2000，稀釋于250 μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium中混勻，室溫孵育20 min，8 h 換液，轉(zhuǎn)染48 h后免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染效率，采用空載體作為對照組。

1.4Real-timePCR用Trizol法提取總RNA。根據(jù)Twist序列設計合成上游及下游引物，Twist S：CGGGAGTCCGCAGTCTTA，Twist A：ACGCCCTGTTTCTTTGA，PCR反應體系(25 μL)：SuperMix 12.5 μL，S引物0.5 μL，A引物0.5 μL，Passive Reference Dye 0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9 μL；程序設置如下：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s 40循環(huán)，72 ℃ 20 s ，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，60～95 ℃ 20 min，95 ℃ 15 s。Realplex軟件導出數(shù)據(jù)并分析。

1.5Westernblot細胞裂解后收集蛋白樣品，根據(jù)碧云天BCA試劑盒說明書中步驟測定蛋白濃度。取45 μL蛋白樣品以12%分離膠，5%濃縮膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上、麗春紅染液中染色，洗膜后5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，山羊抗小鼠二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后顯影及數(shù)據(jù)分析。

1.6克隆形成實驗取對數(shù)生長期細胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，活細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至1×103細胞/mL。用蒸餾水分別制備出12 g/L和7 g/L兩個質(zhì)量濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持40 ℃不凝。按1∶1比例使12 g/L的瓊脂糖和2×DMEM/F12培養(yǎng)液(含有2×抗生素和200 mL/L FBS)混勻后，取3 mL混合液注入直徑6 cm平皿中，冷卻凝固置CO2溫箱中備用。按1∶1比例讓7 g/L的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)液在無菌試管中相混以后，再向管中加入細胞懸液，充分混勻，注入鋪有12 g/L瓊脂糖底層平皿中，逐漸形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37 ℃ CO2溫箱中培養(yǎng)10～14 d。把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數(shù)。按公式計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)=克隆數(shù)/接種數(shù)×100。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行兩組間獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Twist由上海生工生物合成Twist cDNA序列，用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，經(jīng)純化、連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)測序鑒定，cDNA序列總長度與預期大小一致，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的Twist cDNA序列同源，證明Twist cDNA序列已經(jīng)成功構(gòu)建到pEGFP-N1載體上。

2.2免疫熒光檢測pEGFP-N1-Twist轉(zhuǎn)染入SKOV3細胞株將帶有熒光標記的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Twist轉(zhuǎn)染入SKOV3細胞系，轉(zhuǎn)染48 h后，用免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染效率。干預組細胞可穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白，GFP表達量高，轉(zhuǎn)染效率80%以上；對照組未檢測到明顯的熒光蛋白表達(圖1)。轉(zhuǎn)染Twist 36、48、54 h后，Twist免疫熒光均呈陽性，轉(zhuǎn)染結(jié)果可行(圖2)。

2.3重組質(zhì)粒中TwistmRNA和Twist蛋白的表達以GAPDH作為內(nèi)參基因，溶解曲線可見兩個主峰，說明設計的引物特異性良好。干預組的mRNA水平明顯高于空白組和空載體組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白組和空載體組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3B)。干預組Twist蛋白的表達高于空白組和空質(zhì)粒組；空白組和空載體組無明顯差別(圖3A)。

圖1pEGFP-N1-Twist在SKOV3細胞株中的轉(zhuǎn)染

Fig.1 Transfection of pEGFP-N1-Twist into SKOV3 cells

A：無明顯GFP表達；B：GFP表達量高。

圖2pEGFP-N1-Twist轉(zhuǎn)染入SKOV3細胞后不同轉(zhuǎn)染時間的轉(zhuǎn)染效率

Fig.2 Transfection of pEGFP-N1-Twist into SKOV3 cells after different time

A：對照；B：轉(zhuǎn)染36 h后；C：轉(zhuǎn)染48 h后；D：轉(zhuǎn)染54 h后。

2.4pEGFP-N1-Twist對SKOV3細胞克隆形成能力的影響過表達組細胞的克隆計數(shù)(61.67±4.69)明顯多于對照組(32.50±2.81)及空載體組(33.17±3.18)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，對照組和空載體組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4)。

3 討 論

Twist基因于1983年在果蠅中首次發(fā)現(xiàn)，此后在包括人類在內(nèi)的多個物種中相繼被確認，其序列在物種進化過程中高度保守。人Twist基因定位于7p21.2，含2個外顯子和1個內(nèi)含子，編碼的mRNA全長1 669 bp。第 1個外顯子長772 bp，包含整個編碼區(qū)域，其內(nèi)的開放可讀框共609 bp，編碼組成Twist蛋白的202個氨基酸；內(nèi)含子長度538 bp。Twist蛋白分子質(zhì)量為26 ku，等電點為9.591，此蛋白屬于螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)蛋白家族。

圖3TwistmRNA和Twist蛋白的表達

Fig.3 Expressions of Twist mRNA and Twist protein

K：空白組；N：空載體組；O：干預組。

圖4pEGFP-N1-Twist對SKOV3細胞克隆形成能力的影響

Fig.4 The influence of pEGFP-N1-Twist on the colony-forming ability of SKOV3 cells

A：對照組；B：空載體組；C：過表達組。

早期的研究發(fā)現(xiàn)，Twist在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，能誘導果蠅原腸胚腹部細胞通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)失去細胞粘著后形成中胚層[2]。EMT是指細胞間及細胞與胞外間質(zhì)間的連接改變、上皮細胞失去極性并脫離周圍組織，細胞骨架重塑并獲得遷移能力，由此上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的過程。其分子特征是上皮細胞標記物如黏附分子表達的減少、間質(zhì)細胞標記物表達的增加，轉(zhuǎn)化后的細胞形態(tài)上亦具有間質(zhì)細胞的特征。近年來發(fā)現(xiàn)EMT是上皮性惡性腫瘤發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移中的重要過程。Twist參與EMT的全過程并發(fā)揮重要作用[3]。Twist在胃癌、肝癌、乳腺癌、生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)多種惡性腫瘤中表達均上調(diào)。Twist基因的表達上調(diào)與E-鈣黏蛋白的表達下降、腫瘤的惡性程度高、耐藥性增強以及患者生存率低密切相關(guān)[4-5]。體外實驗證明Twist的過表達可降低E-鈣黏蛋白的表達，促進EMT，增加腫瘤細胞遷移能力從而促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[6-8]，在小鼠肺癌模型中Twist基因沉默后可阻止癌細胞的轉(zhuǎn)移擴散[9-10]。

TWIST與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]，與卵巢癌的關(guān)系近年來亦被密切關(guān)注[12-13]。上皮性卵巢癌易復發(fā)轉(zhuǎn)移，缺乏有效的治療手段，病死率很高，嚴重危害女性健康。本實驗構(gòu)建了能夠表達Twist基因的真核質(zhì)粒pEGFP-N1-Twist，并利用Real-time PCR和Western blot驗證目的基因能夠被穩(wěn)定的表達，同時通過pEGFP-N1-Twist使Twist基因過表達，闡明 Twist對卵巢癌SKOV3細胞的克隆形成具有促進作用，為進一步研究上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移的機制奠定了基礎(chǔ)。

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