抗磷脂抗體促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)U937細(xì)胞泡沫化進(jìn)程及對(duì)VEGF分泌的影響

白 玲，劉 平，馬愛群，杜 媛，霍建華，范力宏，強(qiáng) 華

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省分子心臟病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061)

抗磷脂抗體(antiphospholipid antibody, APA)的出現(xiàn)伴隨著臨床高發(fā)的心肌梗死和腦血栓形成。有研究表明APA是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[1-2]。近年來(lái)的研究主要集中在APA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、凝血異常方面。目前為止，APA的生理功能以及在AS形成中的確切機(jī)制尚不清楚。動(dòng)脈壁富含脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞是AS的重要特征，氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)在細(xì)胞內(nèi)集聚是泡沫細(xì)胞得以形成的原因，被自身抗體—抗ox-LDL抗體包被的ox-LDL更易于被單核巨噬細(xì)胞吞噬。已有研究[3]顯示ox-LDL與APA有交叉反應(yīng)，但尚未見APA對(duì)單核巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)分泌的影響的報(bào)道。VEGF是一個(gè)高度特異的血管內(nèi)皮促分裂因子，可促進(jìn)斑塊內(nèi)血管新生，從而與AS斑塊生長(zhǎng)、破裂、出血、血栓形成密切相關(guān)[4-5]。本研究目的在于探討ox-LDL誘導(dǎo)人髓系單核細(xì)胞株U937泡沫化過(guò)程中，APA對(duì)細(xì)胞泡沫化進(jìn)程和分泌VEGF蛋白的影響,從而探討APA致AS的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料人髓系白血病單核細(xì)胞U937購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所。胎牛血清、RPMI 1640購(gòu)自Gibco，膽固醇測(cè)定酶為Sigma公司產(chǎn)品, VEGF的ELISA試劑盒購(gòu)于R&D Systems公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2APA的親和純化、定性及蛋白定量選取6例APA陽(yáng)性冠心病患者，各留取10 mL枸櫞酸抗凝血，用Harris方法制備APA親和純化液。對(duì)提純APA用考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行定量及ELISA進(jìn)行定性檢測(cè)。APA制備液用考馬斯亮藍(lán)G-250定量測(cè)定蛋白濃度為0.35 mg/mL，ELISA定性實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出對(duì)心磷脂高度結(jié)合活性，抗體滴度>1∶100。

1.3LDL的制備、氧化修飾與鑒定常規(guī)分離新鮮健康人空腹血清，序列超速離心分離LDL(d=1.019～1.063 g/mL)，經(jīng)瓊脂糖電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳均顯示單一蛋白帶，Lowrry法測(cè)蛋白濃度。將LDL置于10 μmol/L CuSO4的PBS溶液(pH 7.2)中，37 ℃透析24 h，換200 μmol/L EDTA的PBS終止反應(yīng)，過(guò)濾除菌后4 ℃保存。LDL氧化程度用硫代巴比妥酸反應(yīng)值(TBARS)反映，新鮮的LDL TBARS為1.5 μmol/g，CuSO4處理的LDL的TBARS為22.3 μmol/g，經(jīng)證明LDL已被氧化。

1.4實(shí)驗(yàn)分組U937為懸浮細(xì)胞，用100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞密度為109個(gè)/L，每2 d換液1次，為達(dá)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃?組：正常對(duì)照組、ox-LDL處理組(ox-LDL為80 mg/L)、ox-LDL與APA處理組(ox-LDL為80 mg/L、APA為100 mg/L)，均于處理48 h后收集細(xì)胞。

1.5電鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化將實(shí)驗(yàn)獲取的細(xì)胞用戊二醛固定，1 000 r/min離心10 min，去上清制備細(xì)胞團(tuán)塊，送西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡室，透射電鏡下觀察胞漿內(nèi)脂質(zhì)空泡及細(xì)胞染色質(zhì)的變化。

1.6細(xì)胞內(nèi)膽固醇及膽固醇酯的測(cè)定收集的細(xì)胞用PBS清洗3次，0.7 mL的已烷∶異丙醇(V/V=3∶2)抽提細(xì)胞脂質(zhì)2次，N2氣流下吹干，細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和總膽固醇含量測(cè)定參照修飾的酶熒光法進(jìn)行，測(cè)定熒光強(qiáng)度的激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為407 nm，膽固醇酯為總膽固醇與游離膽固醇之差。

1.7細(xì)胞群染色體DNA片段(DNALadder)的觀察用酚-氯仿-異丙醇抽提細(xì)胞總DNA，15 g/L瓊制糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下觀察DNA片段。

1.8ELISA檢測(cè)VEGF蛋白分泌采用ELISA雙抗夾心法，收集培養(yǎng)細(xì)胞上清液，按說(shuō)明書步驟操作，492 nm處測(cè)定細(xì)胞上清液中VEGF蛋白濃度。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯含量的比較正常對(duì)照組、ox-LDL處理組、ox-LDL與APA處理組細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯的含量見表1。結(jié)果顯示，ox-LDL促使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加，但膽固醇酯與總膽固醇之比小于50%，細(xì)胞整體生化指標(biāo)尚未達(dá)到泡沫化的程度；而APA存在下細(xì)胞攝取ox-LDL增加，該組細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯與總膽固醇之比大于50%，達(dá)到泡沫細(xì)胞的程度。

2.2U937細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變透射電鏡下，正常對(duì)照組U937細(xì)胞內(nèi)無(wú)脂質(zhì)空泡(圖1A)。而ox-LDL處理組細(xì)胞體積增大，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡(圖1B)，但染色質(zhì)無(wú)明顯變化。Ox-LDL與APA共同處理組，細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)空泡進(jìn)一步增加，有些脂質(zhì)融合成空泡，細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。細(xì)胞染色后脂質(zhì)濃縮、靠邊、呈新月形改變，部分細(xì)胞核裂解，出現(xiàn)調(diào)亡小體(圖1C)，說(shuō)明APA不僅促使細(xì)胞內(nèi)ox-LDL堆積，而且導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,加速ox-LDL誘導(dǎo)下U937細(xì)胞的泡沫化進(jìn)程。

表13組細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯含量的比較

組 別例數(shù)膽固醇(mg/g)膽固醇酯(mg/g)總膽固醇(mg/g)膽固醇酯/總膽固醇(%)正常對(duì)照組6215±1087±10302±1328.81ox-LDL組6243±7226±12469±1348.18*ox-LDL+APA組6276±10384±13660±1458.18*△

與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與ox-LDL組相比，△P<0.05；APA：抗磷脂抗體。

圖13組細(xì)胞電鏡下的形態(tài)學(xué)變化

Fig.1 Morphological changes of three group cells under electron microscope (×5 000)

A：正常U937細(xì)胞表面光滑，胞質(zhì)內(nèi)無(wú)脂質(zhì)顆粒；B：電鏡下80 mg/L ox-LDL作用后的U937細(xì)胞，形態(tài)多邊形，形似巨噬細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)可見到脂質(zhì)空泡；C：電鏡下80 mg/L ox-LDL+APA作用后的U937細(xì)胞，部分細(xì)胞核固縮、靠邊，形成新月形改變，可見典型凋亡小體，同時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)泡沫化；APA：抗磷脂抗體。

2.3經(jīng)APA處理后的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象APA處理組的細(xì)胞提取DNA，經(jīng)18 g/L瓊制糖凝膠電泳后出現(xiàn)階梯狀(Ladder)條帶，進(jìn)一步證明電鏡觀察到的APA作用后的細(xì)胞樣品有凋亡細(xì)胞存在(圖2)。

圖2C組DNA“梯形條帶”的瓊脂糖電泳圖

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA“l(fā)adder” in Group C

M2：λ-Hind ⅢDNA marker；C組：APA處理組；M1：100 bp DNA Ladder；APA：抗磷脂抗體。

2.4細(xì)胞分泌VEGF蛋白含量的比較U937細(xì)胞在ox-LDL單獨(dú)作用下，細(xì)胞分泌VEGF較正常細(xì)胞明顯增加；APA與ox-LDL共同作用下，VEGF的分泌進(jìn)一步增加(表2)。

表23組細(xì)胞分泌VEGF蛋白含量的比較

Tab.2 Comparison of the levels of VEGF protein secreted in U937 cells in the three groups

組 別例數(shù)VEGF蛋白的含量(pg/mL)正常對(duì)照組61515±134ox-LDL組62334±178*ox-LDL+APA組62716±145*△

與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與ox-LDL組相比，△P<0.05；APA：抗磷脂抗體。

3 討 論

抗磷脂抗體像同型半胱氨酸一樣也是近年來(lái)被人們意識(shí)到的新型致AS因子，它的出現(xiàn)伴隨著臨床高發(fā)的缺血性心腦血管事件[6-7]。我們既往的研究也表明冠心病患者血清APA的陽(yáng)性率明顯高于正常健康人群[8]。APA通過(guò)與帶負(fù)電荷磷脂的靶物質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮其致病作用，由于作用的靶抗原廣泛存在于體內(nèi)，目前APA致AS的機(jī)制并不清楚。大多學(xué)者認(rèn)為APA與內(nèi)皮細(xì)胞膜上磷脂結(jié)合后使內(nèi)皮細(xì)胞釋放PGI2、NO、細(xì)胞粘附分子、IL-1改變及抗血栓能力減弱是APA致AS的重要機(jī)制。

巨噬細(xì)胞通過(guò)清道夫受體無(wú)反饋性的大量攝取ox-LDL后衍變成富含膽固醇酯的泡沫細(xì)胞是AS的標(biāo)志，而被自身抗體—抗ox-LDL包被的ox-LDL更易于被巨噬細(xì)胞吞噬。有研究顯示APA與ox-LDL有交叉反應(yīng)，APA不能與LDL結(jié)合，卻能與ox-LDL反應(yīng)，可能系LDL被氧化修飾時(shí)暴露出APA作用的靶物質(zhì)[9]，但APA對(duì)ox-LDL的致泡沫細(xì)胞的形成作用并不清楚。本研究結(jié)果表明U937細(xì)胞受ox-LDL作用后細(xì)胞由圓形轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞特有的多角形，表明細(xì)胞由單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，而且生化及形態(tài)學(xué)也顯示胞漿內(nèi)有大量脂質(zhì)沉積，證明ox-LDL是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的主要來(lái)源。雖然整體生化水平上細(xì)胞尚未達(dá)泡沫化程度，可能與ox-LDL作用的劑量及時(shí)間有關(guān)。而在有APA共同存在條件下，透射電鏡可見大量脂滴融合形成脂質(zhì)空泡，胞漿內(nèi)膽固醇酯的含量也超過(guò)總膽固醇的50%，APA處理后的細(xì)胞無(wú)論在形態(tài)上還是生化指標(biāo)均符合泡沫細(xì)胞的定義，說(shuō)明APA有明顯的促ox-LDL誘導(dǎo)下U937細(xì)胞泡沫化進(jìn)程。

此外，當(dāng)APA與ox-LDL共同存在時(shí)，透射電鏡下觀察到U037細(xì)胞染色質(zhì)固縮、靠邊、形成新月體，甚至出現(xiàn)凋亡小體；凝膠電泳DNA也出現(xiàn)“梯狀譜帶”，說(shuō)明APA在促使ox-LDL被攝取的同時(shí)也加速了細(xì)胞的凋亡。AS斑塊中有大量的凋亡細(xì)胞，主要來(lái)源于吞噬脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞[10]。在早期，血管壁主要是巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL以消除對(duì)血管的損害。隨危險(xiǎn)因素持續(xù)存在，脂質(zhì)大量堆積的同時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而凋亡使細(xì)胞崩解脂質(zhì)沉積于血管壁，加速AS的進(jìn)展[11]，也是斑塊不穩(wěn)定因素。本研究發(fā)現(xiàn)APA有促ox-LDL致巨噬細(xì)胞凋亡的作用，說(shuō)明APA有加速血管壁脂質(zhì)沉積作用，從而加速AS形成。

VEGF是一個(gè)高度特異的強(qiáng)血管內(nèi)皮促分裂因子和血管生成因子[12-13]。VEGF作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、生理性和病理性血管增生及血管通透性增加。已有研究表明體內(nèi)斑塊中VEGF表達(dá)增加，誘使AS斑塊內(nèi)血管生成，同時(shí)使粘附分子等炎癥因子產(chǎn)生。促進(jìn)炎癥細(xì)胞對(duì)血管壁的粘附，從而加速AS的進(jìn)展及斑塊的不穩(wěn)定性[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL誘導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程中，VEGF分泌增加，當(dāng)APA存在時(shí)，不僅細(xì)胞脂質(zhì)沉積明顯，凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，同時(shí)細(xì)胞分泌VEGF增加也較ox-LDL單獨(dú)存在時(shí)更為明顯。說(shuō)明APA從多個(gè)環(huán)節(jié)參與AS的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。

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