蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制劑重組蛋白對(duì)小鼠黑色素瘤血管生成擬態(tài)的影響及其機(jī)制

謝 群，林揚(yáng)元，林麗琳，翁劍武，林建銀

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究中心、消化道惡性腫瘤教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350004；2. 福建省莆田學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福建莆田 351100)

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為腫瘤血管即內(nèi)皮依賴性血管是腫瘤獲得營養(yǎng)供應(yīng)的唯一途徑，更是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因。自從1999年MANIOTIS等報(bào)道了在人眼葡萄膜黑色素瘤中存在由腫瘤細(xì)胞圍成的管道結(jié)構(gòu)血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)之后[1]，不斷有研究證實(shí)多種惡性腫瘤存在這種與經(jīng)典腫瘤血管生成途徑不同的模式，且VM與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后緊密相關(guān)[2]，從而為腫瘤的治療提供了全新思路[3]。

蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制劑(snake venom cystatin, sv-cystatin)是從眼鏡蛇(najanajaatra)蛇毒中分離純化的一種新型小分子蛋白質(zhì)。本室前期通過基因工程合成sv-cystatin全基因，通過畢氏酵母(pichiapastoris,p.pastoris)系統(tǒng)表達(dá)并通過固定化金屬離子配體親和層析法 (immobilized metal affinity chromatography, IMAC)純化生產(chǎn)sv-cystatin重組蛋白[4]，研究發(fā)現(xiàn)該重組蛋白可以抑制腫瘤內(nèi)皮依賴性血管生成[5]。為了進(jìn)一步探討sv-cystatin重組蛋白是否具有抗VM作用，本研究擬采用Matrigel膠腫瘤細(xì)胞類血管生成模型、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、C57BL/6小鼠黑色素瘤實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型、CD34和過碘酸雪夫(periodic acid-schiff, PAS)雙重染色及免疫組織化學(xué)染色等方法探討sv-cystatin重組蛋白對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞體內(nèi)外VM形成的影響及相關(guān)機(jī)制，為sv-cystatin抗腫瘤血管生成作用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要材料及試劑胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Matrigel膠購自BD公司；CD34、MMP-2和MMP-9抗體為Santa Cruze公司產(chǎn)品；SP法染色試劑盒為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；PAS試劑盒購自羅基(北京)生物技術(shù)有限公司；C57BL/6小鼠、雌性、體質(zhì)量(18±2)g，6周齡，購自上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司。其余產(chǎn)品均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2藥物和細(xì)胞株Sv-cystatin重組蛋白由本室經(jīng)p.pastoris系統(tǒng)表達(dá)、經(jīng)IMAC純化獲得[4]。小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10引自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)，以含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3方法

1.3.1Matrigel膠腫瘤細(xì)胞類血管生成模型實(shí)驗(yàn) 以每孔15 μL的Matrigel膠(5 mg/mL)包被96孔培養(yǎng)板，收集對(duì)數(shù)生長期B16F10細(xì)胞以每孔1.5×104個(gè)接種于培養(yǎng)板內(nèi)，融合后分別加入終濃度為10、25、50、100和200 mg/L的sv-cystatin重組蛋白，設(shè)立PBS對(duì)照組。常規(guī)培養(yǎng)12、24、36 h后，鏡下每孔選取5個(gè)視野計(jì)算腫瘤細(xì)胞類血管樣結(jié)構(gòu)即VM的數(shù)量。

1.3.2免疫細(xì)胞化學(xué)染色 取上述Matrigel膠腫瘤細(xì)胞類血管生成模型實(shí)驗(yàn)中作用12 h后的細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，按SP法進(jìn)行操作：滴加MMP-2、MMP-9第一抗體，4 ℃孵育過夜后，以相應(yīng)的第二抗體室溫孵育30 min后，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、中性樹膠封片后置顯微鏡下觀察。腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色為陽性表達(dá)，采用圖像分析系統(tǒng)(Leica Qwin 3)于100倍視野下測定陽性染色吸光度值(A)，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)大小相等的視野，結(jié)果以3個(gè)視野的平均值表示。

1.3.3C57BL/6小鼠黑色素瘤實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型 C57BL/6小鼠45只，隨機(jī)分為對(duì)照組，治療組1(每次25 mg/kg)及治療組2(每次50 mg/kg)。用0.154 mol/L的NaCl重懸對(duì)數(shù)生長期B16F10細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106個(gè)/mL，3組小鼠于尾靜脈分別注射200 μL瘤細(xì)胞懸液，兩治療組則分別在注射瘤細(xì)胞前24 h、注射瘤細(xì)胞后2 h及注射瘤細(xì)胞后24 h分三次于尾靜脈注射相應(yīng)劑量sv-cystatin重組蛋白，對(duì)照組則同法注射等體積0.154 mol/L的NaCl。21 d后處死小鼠，取肺組織，計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)，組織經(jīng)固定、包埋、切片與HE染色，鏡下觀察病理改變。

1.3.4CD34和PAS雙重染色 取上述3組小鼠肺組織進(jìn)行SP法CD34免疫組織化學(xué)染色，鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞著色后，終止顯色反應(yīng)將切片置于過碘酸溶液氧化20 min，蒸餾水沖洗3次后置于schiff液中，室溫下PAS反應(yīng)15 min，經(jīng)蘇木素襯染、脫水、透明、樹膠封片。VM的判定：鏡下觀察腫瘤細(xì)胞圍成腔隙樣結(jié)構(gòu)，腔內(nèi)可見紅細(xì)胞，管壁可見呈櫻桃紅色的PAS陽性物質(zhì)圍成基底膜樣結(jié)構(gòu)將腫瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞分開，且CD34染色陰性即沒有血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞，便為擬態(tài)血管VM；管壁有CD34陽性的內(nèi)皮細(xì)胞和PAS染色陽性的結(jié)構(gòu)，無論腔內(nèi)有無紅細(xì)胞則為內(nèi)皮依賴性血管。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取其平均值。

1.3.5免疫組織化學(xué)染色 3組小鼠肺組織進(jìn)行SP法免疫組織化學(xué)染色，第一抗體為MMP-2及MMP-9，參照上述免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法進(jìn)行。肺組織轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色為陽性，采用圖像分析系統(tǒng)(Leica Qwin 3)于100倍視野下測定圖像中的陽性染色的吸光度，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，結(jié)果以3個(gè)視野的平均值表示。

2結(jié)果

2.1sv-cystatin重組蛋白抑制B16F10細(xì)胞體外VM的形成在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)觀察Matrigel膠培養(yǎng)B16F10細(xì)胞VM形成情況。重組蛋白作用12、24、36 h時(shí)對(duì)照組均可見B16F10細(xì)胞胞體細(xì)長，自發(fā)首尾相連形成大量血管腔樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即VM現(xiàn)象，VM形成數(shù)量(個(gè)/視野)分別達(dá)15.78±1.32、18.1±1.342、20.66±1.406，經(jīng)5種濃度重組蛋白作用后B16F10細(xì)胞排列松散，VM數(shù)量減少(圖1)，5個(gè)劑量組(n=5)的VM數(shù)量及與對(duì)照組的比較情況如下：12 h，13.7±1.086(P=0.025)、12±1.523(P=0.000)、10.18±1.632(P=0.000)、9.22±1.301(P=0.000)、8.38±1.312(P=0.000)；24 h，15.46±1.122(P=0.004)、13.56±1.531(P=0.000)、12.46±1.469(P=0.000)、10.52±1.228(P=0.000)、9.36±1.161(P=0.000)；36 h，18.06±1.652(P=0.007)、16±1.503(P=0.000)、14.62±1.026(P=0.000)、12.32±1.439(P=0.000)、11.48±1.188(P=0.000)；各組的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖1 sv-cystatin重組蛋白對(duì)B16F10細(xì)胞VM形成及MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響(SP, ×100)

圖2 各組VM形成數(shù)量的比較

2.2sv-cystatin重組蛋白抑制C57BL/6小鼠黑色素轉(zhuǎn)移瘤VM的形成各組小鼠的肺轉(zhuǎn)移率為100%，對(duì)照組可見大量散在轉(zhuǎn)移灶，瘤細(xì)胞形狀各異，核異型性明顯，兩治療組肺轉(zhuǎn)移灶明顯減小、減少，提示重組蛋白可以抑制小鼠黑色素細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移[4](圖3)；進(jìn)行CD34和PAS雙重染色方法后，如圖4A、4B、4C所示，對(duì)照組中可見小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤內(nèi)存在較多數(shù)量的由B16F10細(xì)胞圍成的、PAS陽性染色但CD34染色陰性的管腔樣結(jié)構(gòu)，形似血管，腔內(nèi)有紅細(xì)胞，外圍未見血管內(nèi)皮細(xì)胞，提示為擬態(tài)血管VM，而僅有CD34染色陽性的內(nèi)皮細(xì)胞圍成的管腔則為內(nèi)皮依賴性血管。對(duì)照組VM形成數(shù)量(個(gè)/視野)為9.04±1.552(n=15)；兩個(gè)治療組中VM形成的數(shù)量(6.36±1.22、3.7±1.07，n=15)與對(duì)照組相比均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4D)。

2.3sv-cystatin重組蛋白抑制B16F10細(xì)胞體內(nèi)外MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)在進(jìn)行體外VM實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測重組蛋白作用12 h后B16F10細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)。MMP-2(圖1A)、MMP-9(圖1B)在5種濃度重組蛋白作用12 h后表達(dá)逐漸降低，與對(duì)照組相比，吸光度值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

圖3 各組C57BL/6小鼠肺轉(zhuǎn)移腫瘤組織病理學(xué)變化

圖4 sv-cystatin重組蛋白對(duì)C57BL/6小鼠黑色素轉(zhuǎn)移瘤VM形成的影響Fig.4 Effects of recombinant sv-cystatin on VM formation in C57BL/6 miceA、B、C分別為對(duì)照、25mg/kg和50mg/kg各組VM及MVD形成;紅色箭頭示VM,藍(lán)色箭頭示MVD;CD34&PAS雙重染色(×400),bar=100μm;D:各組C57BL/6小鼠肺轉(zhuǎn)移灶VM數(shù)量比較;popu-lation variance F=21.213(P=0.000),?P<0.05(P=0.007), vs. 對(duì)照組,#P<0.05(P=0.000), vs. 對(duì)照組。

表1 sv-cystatin重組蛋白對(duì)B16F10細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響

*P<0.05,vs. 對(duì)照組；MMP-2：population varianceF=73.541(P=0.000)；MMP-9：population varianceF=74.909(P=0.000)。

通過SP法檢測小鼠黑色素轉(zhuǎn)移瘤MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，如圖5所示：對(duì)照組MMP-2蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性(0.395±0.013，n=15)，與對(duì)照組相比兩治療組重組蛋白抑制MMP-2表達(dá)(0.329±0.016、0.299±0.014)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖6中顯示對(duì)照組MMP-9蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)(0.355±0.014，n=15)，與對(duì)照組相比兩治療組重組蛋白抑制MMP-2表達(dá)(0.29±0.012、0.26±0.012，n=15)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管。高度惡性腫瘤快速生長僅依賴于經(jīng)典的內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管無法滿足血液供應(yīng)，VM就是最初在黑色素瘤這種惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的一種由腫瘤細(xì)胞環(huán)繞形成的擬態(tài)血管，腫瘤細(xì)胞通過自身變形及與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，模擬血管壁結(jié)構(gòu)形成由一層腫瘤細(xì)胞而不是內(nèi)皮細(xì)胞被覆，管腔內(nèi)可見血細(xì)胞, 有時(shí)可見一層PAS陽性的基質(zhì)膜將腫瘤細(xì)胞和血細(xì)胞分開，從而重塑腫瘤微循環(huán)，為腫瘤生長轉(zhuǎn)移提供更為充足的血液供應(yīng)[6]。現(xiàn)已在卵巢癌、肝癌、胃癌等多種高度惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)[7-8]。

圖5 sv-cystatin重組蛋白對(duì)C57BL/6小鼠黑色素肺轉(zhuǎn)移瘤MMP-2表達(dá)的影響Fig.5 Effects of recombinant sv-cystatin on the expression of MMP-2 in C57BL/6 miceA、B、C分別為對(duì)照、25mg/kg和50mg/kg組MMP-2表達(dá)情況(SP, ×400),bar=100μm;D:各組C57BL/6小鼠MMP-2表達(dá)的比較; population variance F=60.161(P=0.000),?P<0.05(P=0.000),vs.對(duì)照組。

圖6 sv-cystatin重組蛋白對(duì)C57BL/6小鼠黑色素肺轉(zhuǎn)移瘤MMP-9表達(dá)的影響Fig.6 Effects of recombinant sv-cystatin on the expression of MMP-9 in C57BL/6 miceA、B、C分別為對(duì)照組、25mg/kg和50mg/kg組MMP-9表達(dá)情況(SP, ×400),bar=100μm;D:各組C57BL/6小鼠MMP-9表達(dá)的比較;population variance F=71.543(P=0.000),?P<0.05(P=0.000),vs. 對(duì)照組。

本實(shí)驗(yàn)中將B16F10細(xì)胞進(jìn)行matrigel膠三維培養(yǎng)，制作腫瘤細(xì)胞類血管生成模型，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)sv-cystatin重組蛋白能夠抑制B16F10細(xì)胞類管腔樣結(jié)構(gòu)即體外VM形成，且抑制作用呈劑量依賴；進(jìn)而在C57BL/6小鼠黑色素瘤實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型的轉(zhuǎn)移瘤灶內(nèi)也發(fā)現(xiàn)B16F10細(xì)胞彼此間相連，形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，腔內(nèi)可見紅細(xì)胞，證實(shí)了VM的存在，而經(jīng)兩個(gè)不同劑量sv-cystatin重組蛋白治療后瘤結(jié)節(jié)變小，VM數(shù)量顯著減少，說明sv-cystatin重組蛋白具有抑制黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用，且能夠抑制VM的形成，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)sv-cystatin重組蛋白能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、黏附、體外血管生成和微血管密度(microvessel density, MVD)[5]，證實(shí)sv-cystatin能夠同時(shí)抑制血管內(nèi)皮依賴性血管和擬態(tài)血管，提示sv-cystatin作為一種作用廣泛而全面的腫瘤血管生成抑制劑在抗腫瘤血管生成等方面具有較大的應(yīng)用開發(fā)潛能。

血管生成擬態(tài)的形成機(jī)制目前尚不清楚，主要認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞的可塑性相關(guān)，腫瘤細(xì)胞能夠模仿內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為，表達(dá)VEGF、EphA2、MMPs等多種與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的基因[9]。MMPs是一組Zn2+依賴性肽酶，可以降解多種細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中的膠原成分，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成中起重要作用，其中又以MMP-2和MMP-9最為重要[10]。近年來許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-9參與了VM的形成[11-12]。本室前期研究也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染sv-cystatin基因可以抑制MMP-2、MMP-9的活性，提示MMPs可能是sv-cystatin的作用靶酶[13]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)重組蛋白抑制B16F10細(xì)胞體內(nèi)外MMP-2、MMP-9表達(dá)，與VM形成受抑制的結(jié)果相一致，推測重組蛋白抑制VM的作用可能與降低MMPs的表達(dá)有關(guān)，sv-cystatin通過抑制MMP-2、MMP-9表達(dá)導(dǎo)致其對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解減少，減少VM形成，進(jìn)而抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。

總之，sv-cystatin重組蛋白能夠抑制腫瘤細(xì)胞體內(nèi)外VM形成，從而阻斷惡性腫瘤特殊的血液供應(yīng)方式，間接抑制轉(zhuǎn)移瘤形成，是抗腫瘤血管生成的重要途徑，下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)則可能是其抑制VM形成的機(jī)制之一。研究結(jié)果將為sv-cystatin重組蛋白作為抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物的進(jìn)一步研制和開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，而VM也將有望成為高血行轉(zhuǎn)移惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

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