多發(fā)性骨髓瘤患者外周血CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量及凋亡相關(guān)蛋白水平*

梅舒翀 邢莉民 付 蓉 王化泉 李麗娟 瞿 文 王國(guó)錦 劉 鴻王曉明 宋 嘉 吳玉紅 關(guān) 晶 阮二寶 劉 惠 劉春燕 張 田丁少雪 邵宗鴻

多發(fā)性骨髓瘤患者外周血CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量及凋亡相關(guān)蛋白水平*

梅舒翀 邢莉民 付 蓉 王化泉 李麗娟 瞿 文 王國(guó)錦 劉 鴻王曉明 宋 嘉 吳玉紅 關(guān) 晶 阮二寶 劉 惠 劉春燕 張 田丁少雪 邵宗鴻

目的：探討外周血CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）在多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）治療中的作用。方法：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)30例初治、27例完全緩解（CR）MM患者以及25例健康成年人外周血CD4+T細(xì)胞、Tregs數(shù)量，并檢測(cè)Tregs表面功能分子CTLA-4及其凋亡相關(guān)蛋白CD95、bcl-2、Caspase3的表達(dá)，分析其與臨床特點(diǎn)及療效的關(guān)系。結(jié)果：初治組CD4+T細(xì)胞占外周血單個(gè)核細(xì)胞的比例低于對(duì)照組（P＜0.05），Ⅲ期初治患者CD4+T細(xì)胞明顯低于Ⅰ、Ⅱ期患者（P＜0.05）；初治MM組Tregs占CD4+T細(xì)胞比例顯著高于CR組和正常對(duì)照組（P＜0.05），初治Ⅲ期患者Tregs占CD4+T細(xì)胞比例明顯高于初治Ⅰ、Ⅱ期患者（P＜0.05）。初治組、CR組和正常對(duì)照組Tregs的表面CD95表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），初治組CTLA-4表達(dá)高于CR組（P＜0.05）和對(duì)照組（P＜0.01），CR患者CTLA-4高于對(duì)照組（P＜0.05），初治組Tregs胞漿內(nèi)bcl-2水平高于CR組（P＜0.05）和對(duì)照組（P＜0.01），CR組高于對(duì)照組（P＜0.05），初治組和CR組Tregs胞內(nèi)Caspase3的水平低于對(duì)照組（P＜0.05）。初治組Tregs占CD4+比例與骨髓瘤數(shù)量呈正相關(guān)（P＜0.05），且Tregs比例與治療前后漿細(xì)胞下降值成反比（r=0.735，P＜0.05）。結(jié)論：MM患者外周血Tregs水平升高，與瘤細(xì)胞負(fù)荷及疾病的分期呈正相關(guān)，與療效呈負(fù)相關(guān)；Tregs水平增高與其抗凋亡能力增強(qiáng)有關(guān)。

多發(fā)性骨髓瘤 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 流式細(xì)胞術(shù) 凋亡

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是漿細(xì)胞惡性增殖性疾病。MM發(fā)病率逐年升高，國(guó)外統(tǒng)計(jì)資料顯示MM發(fā)生率已經(jīng)超過(guò)白血病，約占全部腫瘤的1%，約占造血系統(tǒng)惡性腫瘤的10%，成為血液系統(tǒng)第二位的惡性腫瘤［1］。1995年，人類(lèi)首次分離獲得具有免疫調(diào)節(jié)作用的CD4+CD25+T細(xì)胞，稱(chēng)之為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）。FoxP3已被證實(shí)是Tregs最可靠及最特異的標(biāo)記［2］，而細(xì)胞表面CD127表達(dá)與FoxP3呈負(fù)相關(guān)，活化的功能性T細(xì)胞高表達(dá)CD127，因而CD127低表達(dá)可替代FoxP3作為檢測(cè)Tregs的標(biāo)記［3-4］。天然的Tregs約占外周血中CD4+T細(xì)胞的5%～10%。Tregs參與調(diào)節(jié)外周免疫耐受，與自身免疫性疾病、腫瘤免疫以及移植耐受免疫發(fā)病密切相關(guān)。已經(jīng)證實(shí)Tregs在許多實(shí)體瘤［5-6］和血液腫瘤中數(shù)量增高［7-8］，但MM患者的Tregs數(shù)量變化存在爭(zhēng)議，文獻(xiàn)報(bào)道不一。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)初治和骨髓完全緩解患者以及健康成年人外周血CD4+、CD4+CD25+CD127lowTregs的數(shù)量及其部分凋亡相關(guān)蛋白水平，并研究其與臨床特點(diǎn)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液科2013年01月至2013年11月收治初治患者組30例，男性17例，女性13例；年齡64（39～76）歲。ISS分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期6例，Ⅲ期19例。分型：IgG 17例、IgA 9例、輕鏈型3例、不分泌型1例；骨髓完全緩解組：27例男性15例，女性12例，中位年齡59（44～67）歲；25例正常對(duì)照，男性12例，女性13例，年齡40（26～56）歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

FACSCalibur流式細(xì)胞儀、PerCP標(biāo)記的鼠抗人CD4抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體、APC標(biāo)記的鼠抗人CD127抗體、PE標(biāo)記的鼠抗人CTLA-4、CD95、bcl-2及Caspase3抗體以及溶血素、PBS均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)方法 用肝素抗凝管抽取實(shí)驗(yàn)對(duì)象空腹外周血3 mL，采集后均在24 h內(nèi)染色、上機(jī)檢測(cè)。1.3.2 CD4+T細(xì)胞、Tregs比例及Tregs膜表面CTLA-4、CD95表達(dá)率的檢測(cè) 取3個(gè)流式管（A、B、C），均加入PerCP標(biāo)記的鼠抗人CD4抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體、APC標(biāo)記的鼠抗人CD127抗體各20 μL，然后A、B、C3個(gè)管依次加入PE標(biāo)記的同型不相關(guān)鼠抗人IgG1（同型對(duì)照）、鼠抗人CTLA-4、CD95各20 μL。3個(gè)管分別加入新鮮肝素抗凝外周血100 μL。混勻，4℃避光孵育30 min，加入2 mL溶血素，混勻，室溫避光孵育10 min，1 500 r/min離心5 min，去除上清液，加入PBS 1 mL，離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min，去除上清液，加PBS 300 μL上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 Tregs胞漿內(nèi)bcl-2、Caspase3的熒光強(qiáng)度檢測(cè)

取3個(gè)流式管（D、E、F），3個(gè)管都加入PerCP標(biāo)記的鼠抗人CD4抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體、APC標(biāo)記的鼠抗人CD127抗體各20μL，3個(gè)管分別加入新鮮肝素抗凝外周血100 μL，混勻，4℃避光孵育30 min，加入2 mL溶血素，混勻，室溫避光孵育10 min，離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min，去除上清液，分別加入1 mL破膜劑，室溫避光孵育10 min，加入PBS 1 mL，1 500 r/min離心5 min，去除上清液。然后D、E、F三管依次加入PE標(biāo)記的同型不相關(guān)鼠抗人IgG1（同型對(duì)照）、鼠抗人bcl-2、Caspase3各20 μL，4℃孵育30 min，加入PBS 1 mL，1 500 r/min離心5 min，去除上清液，加PBS 300 μL上機(jī)檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CD4+T細(xì)胞占外周血單個(gè)核細(xì)胞的比例

初治組CD4+T細(xì)胞占外周血單個(gè)核細(xì)胞的比例為（29.41±12.56）%，骨髓CR組為（31.13±12.38）%，對(duì)照組為（34.78±3.84）%。初治組明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），與骨髓CR組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），骨髓CR組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表1）。

初治組按ISS分期：Ⅰ、Ⅱ期患者CD4+T細(xì)胞占外周血單個(gè)核細(xì)胞的比例為占（36.32±7.24）%；Ⅲ期（28.44±13.01）%，Ⅲ期患者低于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.05）。IgG型患者CD4+T細(xì)胞占外周血單個(gè)核細(xì)胞的比例（31.52±11.87）%，IgA型患者為（34.5±9.08）%，兩者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

2.2 Tregs占CD4+T細(xì)胞的比例

初治組外周血 Tregs/CD4+T比值為（9.34± 4.74）%；骨髓CR組為（7.31±2.10）%，正常對(duì)照組為（6.95±1.59）%。初治組明顯高于骨髓CR組和對(duì)照組（P均＜0.05）；骨髓CR組與正常對(duì)照組無(wú)差異（P＞0.05）。初治組按ISS分期：Ⅰ、Ⅱ期患者外周血Tregs/ CD4+T比值為（6.78±2.34）%；Ⅲ期（10.57±5.21）%，Ⅲ期患者明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IgG型患者外周血Tregs/CD4+比值為（8.79±4.26）%與IgA型外周血Tregs/CD4+T比值為（9.83±5.45）%，兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

2.3 MM患者Tregs表面功能分子CTLA-4的表達(dá)

初治組Tregs表面CTLA-4分子的表達(dá)率（4.65± 1.68）%，骨髓CR組（2.83±1.72）%，對(duì)照組為（1.64± 0.85）%，初治組明顯高于骨髓CR組（P＜0.05）及對(duì)照組（P＜0.01），骨髓CR組仍高于對(duì)照組（P＜0.05，表2）。2.4 MM患者Tregs表面CD95的表達(dá)

初治組Tregs表面CD95分子的表達(dá)率（61.30± 13.0）%，骨髓CR組（59.65±9.68）%，對(duì)照組（58.79± 9.53）%，各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表2）。

2.5 MM患者Tregs胞漿內(nèi)bcl-2、Caspase3分子表達(dá)

初治組Tregs胞漿內(nèi)bcl-2熒光強(qiáng)度（772.02± 196.34），骨髓CR組（597.39±126.84），對(duì)照組（456.93± 74.75），初治組明顯高于骨髓CR組（P＜0.05）和對(duì)照組（P＜0.01）；骨髓CR組仍高于對(duì)照組（P＜0.05）。初治組Tregs細(xì)胞內(nèi)Caspase3的熒光強(qiáng)度為（32.48± 6.97）和骨髓CR組（37.69±7.59）均明顯低于對(duì)照組（53.15±3.55，P均＜0.05），初治組和骨髓CR組無(wú)明顯差異（P＞0.05，表2）。

2.6 Tregs占CD4+T細(xì)胞的比例與臨床特點(diǎn)及療效的相關(guān)性

Tregs/CD4+T比值與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓中惡性漿細(xì)胞水平呈正相關(guān)（r=0.373，P=0.043，圖1A），與胸、髂骨骨髓涂片惡性漿細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)（r=0.526，P=0.003，圖1B）、（r=0.693，P=0.000，圖1C），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tregs/CD4+T比值與血清β2-MG（r=0.072，P= 0.711），血清LDH水平（r=0.304，P=0.109），血肌酐值（r=0.006，P=0.975），血尿素水平（r=0.004，P=0.985），均無(wú)相關(guān)性。15例經(jīng)VD方案化療患者，Tregs/CD4+比值治療后的骨髓中瘤細(xì)胞下降比例呈負(fù)相關(guān)（r=0.735，P＜0.01，圖1D）。

表1 各組間外周血CD4+T細(xì)胞比例以及CD4+CD25+CD127low/CD4+T比較 （±s）%Table1 Comparison of percentage of CD4+T in PBMCs and CD4+CD25+CD127lowin CD4+T among these groups（±s）%

表1 各組間外周血CD4+T細(xì)胞比例以及CD4+CD25+CD127low/CD4+T比較 （±s）%Table1 Comparison of percentage of CD4+T in PBMCs and CD4+CD25+CD127lowin CD4+T among these groups（±s）%

Case 30 27 25 19 11 17 9 CD4+T/PBMC 29.41±12.56△31.13±12.38 34.78±3.84 28.44±13.01&36.32±7.24 31.52±11.87 34.5±9.08 CD4+CD25+CD127low/CD4+T 9.34±4.74△#7.31±2.10 6.95±1.59 10.57±5.21&6.78±2.34 8.79±4.26 9.83±5.45 Group Newly diagnosed Bone marrow CR Healthy controlsⅢ（ISS）Ⅰ/Ⅱ（ISS）IgG IgA△：compared with healthy controls，P＜0.05；#：compared with bone marrow CR，P＜0.05；&compared withⅠ/Ⅱ（ISS），P＜0.05

表2 各組間Tregs膜表面CTLA-4和CD95表達(dá)率以及bcl-2和Caspase3熒光強(qiáng)度的比較Table 2 Comparison of expression of CTLA-4 and CD95 and the fluorescence intensity of bcl-2 and Caspase3 among these groups

3 討論

Tregs是一群具有免疫負(fù)調(diào)控功能的T細(xì)胞亞群，在維持對(duì)自身成分免疫耐受的同時(shí)，也阻止機(jī)體對(duì)自體同源腫瘤細(xì)胞的免疫，導(dǎo)致腫瘤的免疫抑制及免疫逃逸。既往研究多采用CD4+CD25+標(biāo)記Tregs，但活化的功能T細(xì)胞表面也表達(dá)CD25［9］，因而以CD4+CD25+標(biāo)記Tregs并不準(zhǔn)確。FoxP3已被證實(shí)是Tregs最特異的的標(biāo)志，因其在胞內(nèi)表達(dá)，標(biāo)記時(shí)需要對(duì)其破膜處理，一旦破膜，將無(wú)法進(jìn)行功能研究。CD127高表達(dá)于活化的功能T細(xì)胞，而Tregs低表達(dá)，且細(xì)胞表面CD127表達(dá)與FoxP3呈負(fù)相關(guān)，因此CD127低表達(dá)可替代FoxP3作為檢測(cè)Tregs的標(biāo)志。故本研究采用CD4+CD25+CD127low作為T(mén)regs。目前MM中Tregs數(shù)量和功能的認(rèn)識(shí)存在爭(zhēng)議，Gupta等［10］和Prabhala等［10］報(bào)道顯示，MM中Tregs數(shù)量下降；而B(niǎo)eyer等［12］認(rèn)為MM患者CD4+CD25+FoxP3+Tregs數(shù)量明顯增加，且隨著疾病的進(jìn)展Tregs數(shù)量及膜分子CCR7、CD45RA的表達(dá)相應(yīng)增加，抑制活性增強(qiáng)，這與本研究結(jié)果是一致的。本研究結(jié)果顯示初治MM患者外周血Tregs占CD4+T比例顯著高于骨髓完全緩解組和對(duì)照組：初治組中Ⅲ期患者明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，但與分型無(wú)關(guān)。本研究結(jié)果提示在MM隨著病情進(jìn)展，Tregs逐漸升高，持續(xù)抑制體內(nèi)正常免疫。Muthu Raja等［13］研究同樣發(fā)現(xiàn)MM患者Tregs升高，并發(fā)現(xiàn)Tregs數(shù)量與患者預(yù)后有密切關(guān)系：Tregs數(shù)量越高，疾病進(jìn)展時(shí)間越短，Tregs數(shù)量明顯增高的患者常常伴隨著不良的臨床特征（如高鈣血癥等），提示Tregs數(shù)量可作為MM的一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后影響因素。我們還發(fā)現(xiàn)Tregs/CD4+T比值與惡性漿細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，且與VD方案化療敏感性呈負(fù)相關(guān)，同樣提示Tregs水平增高是一個(gè)預(yù)后不良因素。

圖1 CD4+CD25+CD127low/CD4+T比值與漿細(xì)胞數(shù)以及VD方案化療之后漿細(xì)胞變化的相關(guān)性Figure 1 The correlation between the percentage of CD4+,CD25+,and CD127low/CD4+T and the malignant plasma cell count and ratio of plasma cell reduction after the first VD chemotherapy

MM患者外周血Tregs的比例增高，是否與其凋亡異常有關(guān)呢？為此進(jìn)一步檢測(cè)其膜表面及胞漿內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，初治、骨髓CR的MM患者和正常人膜表面CD95表達(dá)率在3組之間無(wú)差異，這提示MM患者Tregs本身不存在Fas/FasL系統(tǒng)的異常。但是胞漿內(nèi)bcl-2和Caspase3的熒光強(qiáng)度在3組之間有顯著的差異，初治組bcl-2明顯高于其他兩組，即使骨髓CR患者仍具有高熒光強(qiáng)度的bcl-2的表達(dá)。而Caspase3的熒光強(qiáng)度在初治組和骨髓CR組均明顯低于對(duì)照組，而初治組和骨髓CR組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示MM患者Tregs抗凋亡能力增強(qiáng)，促凋亡減弱，兩者共同作用使得Tregs不斷“累積”，進(jìn)而抑制MM患者的正常免疫，使病情進(jìn)展。Muthu Raja等［13］研究發(fā)現(xiàn)，Tregs對(duì)CD4+T細(xì)胞抑制作用與Tregs數(shù)量呈正相關(guān)。提示MM患者體內(nèi)Tregs數(shù)量的不斷增多，其抑制效應(yīng)也是不斷增強(qiáng)的。

MM患者Tregs膜表面CTLA-4的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，骨髓CR后仍高表達(dá)。CTLA-4與CD28均為共刺激分子B7的受體，主要表達(dá)于被激活T細(xì)胞表面，CTLA-4與CD28分子的功能相反，CTLA-4與B7結(jié)合后抑制小鼠和人T細(xì)胞的激活，在T細(xì)胞活化中起負(fù)調(diào)節(jié)作用［14］。研究發(fā)現(xiàn)CTLA-4是CD4+CD25+Foxp3+Tregs的一個(gè)重要功能分子，能夠抑制Tregs誘導(dǎo)細(xì)胞活化死亡，維持其在體內(nèi)的穩(wěn)定性［15］。

MM患者Tregs數(shù)量升高，抑制功能的增強(qiáng)，凋亡能力下降，Treg數(shù)量可作為監(jiān)測(cè)MM的預(yù)后指標(biāo)之一。

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（2014-05-09收稿）

（2014-06-10修回）

（本文編輯：鄭莉）

Quantity and apoptosis-related protein levels of CD4+,CD25+, and CD127lowregulatory T cells in peripheral blood of multiple myeloma patients

Shuchong MEI,Limin XING,Rong FU,Huaquan WANG,Lijuan LI,Wen QU,Guojin WANG,Hong LIU,Xiaoming WANG,Jia SONG,Yuhong WU,Jing GUAN,Erbao RUAN,Hui LIU,Chunyan LIU,Tian ZHANG,Shaoxue DING,Zonghong SHAO

Zonghong SHAO;E-mail:shaozonghong@sina.com

Objective:To investigate the role of CD4+,CD25+,and CD127lowregulatory T cells(Tregs)in multiple myeloma(MM).Methods:Levels of CD4+T cells and Tregs,as well as expression of CTLA-4 and apoptosis-related proteins,such as CD95,bcl-2,and Caspase3 of Tregs in peripheral blood of 30 patients with newly diagnosed cases,27 patients under of complete remission(CR)from multiple myeloma patients,and 25 healthy adults were analyzed by flow cytometry.Results:The percentage of CD4+T cells in the untreated group was significantly lower than that of the control group(P＜0.05).The percentage of Tregs in CD4+T cells in the untreated group was significantly higher than that of the CR group and control group(P＜0.05),which in ISSⅢpatients of the untreated group was significantly higher than that in I/II(P＜0.05).No significant difference of CD95 expression in Tregs was observed among the three groups.The expression of CTLA-4 in Tregs from the untreated group was significantly higher than that of the CR group(P＜0.05)and control group(P＜0.01),and so was in CR group than this in controls(P＜0.05).The expression of bcl-2 in Tregs in the untreated group was significantly higher than that of the CR group(P＜0.05)and control group(P＜0.01),and so was in CR group than this in controls(P＜0.05).The expression of Caspase3 in Tregs from the untreated group and CR group were all significantly lower than that of the control group(P＜0.05).The percentage of Tregs in CD4+T cells in the untreated group was positively correlated with the proportion of bone marrow plasma cells(P＜0.05).The percentage of Tregs in CD4+T cells from 15 MM patients who

bortezamib and dexamethasone(VD)chemotherapy was negatively correlatedto the ratio of plasma cell reduction after the first VD chemotherapy(r=0.735,P＜0.01).Conclusion:The level of Tregs in the peripheral blood of MM patients was positively correlated with tumor burden and progression of disease,but was negatively correlated with curative effect.The increased level of Tregs was associated with their strengthened anti-apoptosis function.

multiple myeloma,regulatory T cells,flow cytometry,apoptosis

10.3969/j.issn.1000-8179.20130808

梅舒翀 碩士研究生在讀。研究方向?yàn)槎喟l(fā)性骨髓瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液科（天津市300052）

*本文課題受天津市抗癌重大專(zhuān)項(xiàng)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：12ZCDZSY17900，12ZCDZSY18000）；中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)多發(fā)性骨髓瘤基金計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：20111207）資助

邵宗鴻 shaozonghong@sina.com

Department of Hematology,General Hosptial,Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China

This study was supported by the Anticancer Major Special Project of Tianjin(No.12ZCDZSY17900,12ZCDZSY18000)and

Chinese MedicalAssociation of Multiple Myeloma Foundation Project(No.20111207)

E-mail：meishuchong716@163.com