基于頭孢克肟的熒光熄滅效應(yīng)用于微量鉻(VI)的靈敏檢測

伍 娉，何婧琳,*，曹小妹，朱爽麗，潘 暢，曹 忠,*

(1.長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，電力與交通材料保護湖南省重點實驗室，湖南長沙410004)

(2.湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長沙410081)

0 引言

鉻不僅是人體必需的微量元素，也是污染環(huán)境及影響人類健康的有害金屬元素。其中，Cr(VI)與環(huán)境和人們的生活密切相關(guān)，它在生物體內(nèi)具有很強的流動性，可通過細胞膜，并促使其氧化，對細胞產(chǎn)生毒害影響，導(dǎo)致病變、甚至致癌，因此對Cr(VI)的分析一直受到人們的高度重視[1～2]。

目前，測定鉻的方法主要有火焰原子吸收光譜法[3]、電化學(xué)法[4]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）[5～6]、高效液相色譜-紫外檢測法（LC-UV）[7～8]、毛細管電泳-紫外檢測法（CE-UV）[9]和分光光度法[10]等，這些方法大都存在靈敏度和選擇性低、操作繁瑣、分析費用高的缺點，導(dǎo)致應(yīng)用受到限制。Paul等[11]建立了一種顯色法檢測人體尿液中的Cr(VI)，即利用1,5-二苯卡巴肼（DPC）與 Cr(VI)形成 DPC-Cr(VI)絡(luò)合物的原理，將試劑加入到尿液中，會立即出現(xiàn)紅紫色從而達到檢測的目的。熒光分光光度法以其高靈敏度和選擇性等優(yōu)點而得到了廣泛的應(yīng)用，可用于鉻的分析測定[12]；Wang等[13]利用二苯乙烯基腎上腺素衍生物作為熒光探針，在加入Cr3+之后，顯示出強的紅色熒光特性，該方法特異性好。然而，以頭孢克肟為熒光探針來測定環(huán)境水樣中微量Cr(VI)的研究還很少有報道。

頭孢克肟是一種口服的第三代頭孢菌素抗生素，化學(xué)名為7,2(2-(氨基-4-噻唑基)-2-(羧甲氧)乙酰氨基)-3-乙烯基-頭孢烯-4-羧酸[14～15]，該藥物分子可與一些金屬離子形成配合物[16]。Ganjali等[17]發(fā)現(xiàn)頭孢克肟可作為一種對Yb3+響應(yīng)敏感的離子載體，并制備了PVC膜電極，實現(xiàn)對Yb3+的電化學(xué)檢測。

基于此，該文提出了一種基于頭孢克肟的微量金屬Cr(VI)熒光探針分析方法。該方法使用頭孢克肟作為熒光探針試劑、Cr(VI)為電子受體，Cr(VI)受體與頭孢克肟供體形成不發(fā)光的基態(tài)配合物，導(dǎo)致頭孢克肟熒光熄滅，從而對Cr(VI)進行定量檢測。該方法操作簡單、靈敏度高、選擇性好，可用于環(huán)境水樣中Cr(VI)含量的測定，在構(gòu)建熒光傳感分析方法方面具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LS-45型熒光分光光度計（美國Perkin Elmer公司），TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），BS124S電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司），KQ3200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司），95-2型磁力攪拌器 （上海司樂儀器有限公司），CZ-500L-W型超純水制備儀 （北京國之源有限公司），TG16-W型臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。

頭孢克肟購自于深圳致君制藥有限公司，重鉻酸鉀、甲醇、氯化鉀、氯化鈉、氯化鈣、氯化鋅、氯化鎂、氯化鋇、鹽酸購自于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，實驗用水為經(jīng)過重蒸餾的去離子水，所用試劑均為分析純。

1.2 溶液的配制

頭孢克肟儲備液：稱取0.225 0 g頭孢克肟粉末于燒杯中，使用甲醇溶解，在磁力攪拌器上攪拌10 min，再在離心機中以3 000 r/min離心5 min，取上清液，轉(zhuǎn)入 25.00mL的容量瓶中，使用甲醇定容、搖勻，其濃度為9.000 mg/mL，使用時可逐級稀釋。

Cr(VI)標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取0.735 5 g重鉻酸鉀于燒杯中，使用去離子水溶解，轉(zhuǎn)入25.00mL的容量瓶中，用去離子水定容、搖勻，配制成0.200 0 mol/L Cr(VI)溶液，使用時可逐級稀釋。

1.3 實驗方法

在石英比色皿中，加入適量的頭孢克肟和Cr(VI)，以甲醇-鹽酸(1.0×10-3mol/L)溶液（1∶1，V/V）為介質(zhì)，選擇激發(fā)/發(fā)射狹縫寬度為10 nm/10 nm，最大激發(fā)/發(fā)射波長為397 nm/438 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 識別機理的探討

頭孢克肟為含有硫、氮元素的雙雜環(huán)分子，能夠和一些金屬離子如 Cu(Ⅱ)，Cd(Ⅱ)，F(xiàn)e(Ⅲ)和Ni(Ⅱ)等形成配合物[16]。該實驗研究發(fā)現(xiàn)頭孢克肟可與Cr(VI)形成配合物，其紫外-可見光譜圖如圖1所示。由圖1可知，頭孢克肟與Cr(VI)形成的配合物在330 nm和435 nm處存在最大吸收峰（圖1d），而頭孢克肟的最大吸收峰在280 nm處（圖1c），Cr(VI)在鹽酸溶液和甲醇-鹽酸溶液的吸收光譜在208 nm及310 nm波長處顯示出兩個波峰（圖1a和1b）；當(dāng)頭孢克肟與Cr(VI)作用后，所形成配合物的吸收光譜出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象（圖1d）。

由于頭孢克肟分子結(jié)構(gòu)存在較大的共軛體系，具有較強的電荷供體的性質(zhì)而具備熒光效應(yīng)。而Cr(VI)是強的電子受體，當(dāng)Cr(VI)與頭孢克肟相互碰撞作用時，會形成不發(fā)光的配合物，從而使得頭孢克肟的熒光發(fā)生淬滅，如圖2所示。

2.2 熒光熄滅效應(yīng)的檢測

為了進一步驗證該傳感方法的可行性，如圖2所示，對不同實驗體系進行了熒光檢測。曲線a顯現(xiàn)出較強的熒光，是因為頭孢克肟溶液本身由于其特殊的共軛體系分子結(jié)構(gòu)而具備的熒光性質(zhì)。而當(dāng)頭孢克肟溶液中加入Cr(VI)溶液后（曲線b），熒光強度減弱，表明Cr(VI)受體與頭孢克肟供體分子形成基態(tài)配合物而產(chǎn)生熒光淬滅作用。由于甲醇分子中的-OH基團的孤對電子躍遷導(dǎo)致其具有微弱的熒光性質(zhì)[18]，因此實驗過程中同時考察了甲醇與 Cr(VI)的相互作用，對比 a、b、c、d曲線可知，甲醇的熒光效應(yīng)對該熒光淬滅分析方法影響不大。

圖1 不同溶液體系的紫外-可見光譜圖:a.Cr(VI)/HCl；b.Cr(VI)/甲醇-HCl；c.頭孢克肟/甲醇-HCl；d.頭孢克肟-Cr(VI)/甲醇-HCl.甲醇-HCl(1.0×10-3 mol/L)介質(zhì)溶液的體積比為1∶1Fig.1 UV-Vis absorption spectra of different solutions including Cr(VI)/HCl(a),Cr(VI)/methanol-HCl(b),Cefixime/methanol-HCl(c),and Cefixime-Cr(VI)/methanol-HCl(d).The volume ratio of methanol-HCl(1.0×10-3mol/L)media solution is 1∶1

圖2 不同溶液體系的熒光光譜圖:a.頭孢克肟；b.頭孢克肟-Cr(VI)；c.甲醇-HCl；d.Cr(VI).[Cr(VI)]=2.0×10-6 mol/L，介質(zhì)為甲醇-HCl(1.0×10-3mol/L)溶液（1∶1,V/V）Fig.2 Fluorescence spectra of different solutions including cefixime(a),cefixime-Cr(VI)(b),methanol-HCl(c),and Cr(VI)(d).[Cr(VI)]=2.0×10-6mol/L.The media is methanol-HCl(1.0×10-3mol/L)solution(1∶1,V/V)

2.3 頭孢克肟質(zhì)量濃度的優(yōu)化

頭孢克肟溶液濃度過低，則熒光強度值小，而頭孢克肟溶液濃度過高，會產(chǎn)生內(nèi)濾效應(yīng)使得熒光自淬滅，因此考察頭孢克肟溶液濃度對該體系的影響是十分重要的。圖3為頭孢克肟溶液質(zhì)量濃度與熒光信號強度值的關(guān)系圖。選取頭孢克肟溶液的質(zhì)量濃度分別為2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0 mg/mL、7.0 mg/mL、8.0mg/mL、9.0 mg/mL，測定其熒光強度變化（圖3a）。由圖可知，隨著頭孢克肟溶液質(zhì)量濃度的增加，其熒光效應(yīng)不斷增強，當(dāng)頭孢克肟溶液質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL時，熒光強度值達到最大，繼續(xù)加大頭孢克肟質(zhì)量濃度，熒光強度由于自淬滅效應(yīng)而降低，如圖3b所示。故實驗選用頭孢克肟溶液質(zhì)量濃度為 8.0 mg/mL。

圖3 不同質(zhì)量濃度的頭孢克肟溶液的熒光光譜圖（a）及頭孢克肟溶液質(zhì)量濃度與其熒光強度的關(guān)系圖（b）.[Cr(VI)]=2.0×10-5mol/L，介質(zhì)為甲醇-HCl(1.0×10-3mol/L)溶液（1∶1,V/V）Fig.3 Fluorescence spectra of different concentrations of cefixime(a)and effect of cefixime concentration.[Cr(VI)]=2.0×10-5mol/L.The media is methanol-HCl(1.0×10-3mol/L)solution(1∶1,V/V)

2.4 頭孢克肟與Cr(VI)作用時間的優(yōu)化

由于設(shè)計的熒光分析方法是基于物質(zhì)之間形成基態(tài)配合物的原理，因此物質(zhì)之間相互反應(yīng)作用時間的優(yōu)化是十分必要的。實驗過程中，將頭孢克肟與Cr(VI)的反應(yīng)時間對測定的影響作為一項優(yōu)化條件進行考察。圖4顯示出了不同培育時間對該熒光分析的影響。由圖4可知，隨著培育時間的增加，反應(yīng)體系的熒光強度值降低，當(dāng)時間達到10 min后，該體系的熒光強度值變化不大，說明頭孢克肟與Cr(VI)的反應(yīng)已經(jīng)達到飽和狀態(tài)。因此，實驗過程中選擇10 min為頭孢克肟與Cr(VI)的反應(yīng)最佳時間。

圖4 頭孢克肟與Cr(VI)的作用時間與熒光強度的關(guān)系圖.[Cr(VI)]=2.0×10-4mol/L，介質(zhì)為甲醇-HCl(1.0×10-3 mol/L)溶液（1∶1,V/V）Fig.4 Effect of incubating time between cefixime and Cr(VI).[Cr(VI)]=2.0×10-4mol/L.The media is methanol-HCl(1.0×10-3mol/L)solution(1∶1,V/V)

2.5 選擇性的考察

為了考察該方法對Cr(VI)檢測的選擇性，以常見的 K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+作為干擾離子進行熒光測試（圖5）。 固定 Cr(VI)為 2.0×10-4mol/L，其他金屬離子的濃度均為 1.0×10-3mol/L。由圖5可知，該熒光方法檢測Cr(VI)的淬滅比率為 1.5， 而加入 K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+后，該熒光方法檢測的淬滅比率約為0.1，即加入K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+后的體系幾乎無響應(yīng)信號，對Cr(VI)的檢測不產(chǎn)生干擾，表明該方法對Cr(VI)有良好的選擇性。

圖5 干擾離子效應(yīng)柱狀圖.Cr(VI)的濃度為2.0×10-4 mol/L，K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+的濃度為 1.0×10-3 mol/L.介質(zhì)為甲醇-HCl(1.0×10-3mol/L)溶液（1∶1,V/V）Fig.5 Effect of interferring ions.The concentration of Cr(VI)is 2.0×10-4mol/L,and K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+1.0×10-3mol/L.The media is methanol-HCl(1.0×10-3mol/L)solution(1:1,V/V)

2.6 Cr(VI)的定量檢測

考察了基于頭孢克肟的新型載體化合物的微量金屬離子熒光探針分析方法的定量分析性能，將不同濃度的Cr(VI)加入體系中，進行熒光分析檢測，實驗結(jié)果如圖6所示。 傳感體系的熒光強度值隨著Cr(VI)濃度的增加而降低（圖6a）。圖6b為傳感體系對應(yīng)的熒光強度值與Cr(VI)濃度對數(shù)的關(guān)系圖，當(dāng) Cr(VI)濃度在 1.0×10-6～2.0×10-3mol/L范圍內(nèi)時，其熒光強度值與Cr(VI)濃度對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，其線性方程可擬合為 F=-25.09lgc-36.61， 線性相關(guān)系數(shù)為 r=0.995 6，且根據(jù)三倍標(biāo)準(zhǔn)偏差法計算得出檢測限為 5.8×10-7mol/L，表明該方法對于 Cr(VI)的定量檢測具有較好的可行性。相較于復(fù)雜的原子吸收、高效液相色譜等儀器分析方法來說，該方法具有操作簡單、快速、實用性強的優(yōu)點，在構(gòu)建簡單靈敏的金屬離子分析方法方面具有較好的應(yīng)用價值。

2.7 水樣分析

取云影湖水（湖南長沙）靜置，取上清液過濾3～5次之后，加入高溫滅菌后的超純水將湖水樣品稀釋10倍，在優(yōu)化的實驗條件下，運用加標(biāo)回收方法，測定湖水樣品中加入不同標(biāo)準(zhǔn)濃度Cr(VI)溶液前后熒光強度值的變化，結(jié)果如表1所示，可計算出平均回收率為97.23%，說明該熒光探針分析方法對實際樣品中Cr(VI)的檢測具有較好的可行性，可應(yīng)用于環(huán)境水樣中的Cr(VI)含量的檢測。

圖6 不同濃度Cr(VI)溶液對頭孢克肟溶液的熒光光譜圖（a）和線性關(guān)系圖（b）.圖中Cr(VI)濃度由上至下分別為：0 mol/L,1.0×10-6mol/L,2.0×10-6mol/L,2.0×10-5mol/L,2.0×10-4mol/L,1.0×10-3mol/L,2.0×10-3mol/L.介質(zhì)為甲醇-HCl(1.0×10-3mol/L)溶液（1∶1,V/V）Fig.6 Fluorescence spectra(a)and a linear response plot of cefixime for different concentrations of Cr(VI)(b).The concentrations of Cr(VI)from up to down are 0 mol/L,1.0×10-6mol/L,2.0×10-6mol/L,2.0×10-5mol/L,2.0×10-4 mol/L,1.0×10-3mol/L and 2.0×10-3mol/L.The media is methanol-HCl(1.0×10-3mol/L)solution(1∶1,V/V)

表1 水樣中Cr(VI)的測定Tab.1 Determination of Cr(VI)in water samples

3 結(jié)論

該文利用Cr(VI)受體與頭孢克肟供體形成不發(fā)光的基態(tài)配合物，建立了一種靈敏檢測Cr(VI)的熒光探針分析方法。在優(yōu)化的實驗條件下，Cr(VI)溶液濃度對數(shù)值與熒光信號值在 1.0×10-6～2.0×10-3mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測限為5.8×10-7mol/L。 該方法對 Cr(VI)表現(xiàn)出較好的選擇性，可用于環(huán)境水樣中Cr(VI)的靈敏檢測。該方法在設(shè)計上具有普遍應(yīng)用性且不需要預(yù)處理，可直接進行測定，具有較好的應(yīng)用前景。

[1]孔祥瑞.必需微量元素的營養(yǎng)、生理和臨床意義[M].合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1982：51.

[2]Shunji U,Takashige K,Nobuyuki S.Detection of chromate(VI)-induced DNA strand breaks and formation of paramagnetic chromium in multiple mouse organs[J].Toxicol.Appl.Pharmacol.,2001,170:56～62.

[3]Liang P,Ding Q,Liu Y.Speciation of chromium by selective separation and precon-centration of Cr(Ⅲ)on an immobilized nanometer titanium dioxidem icrocolumn[J].J.Sep.Sci.,2006,29:242～247.

[4]Ouyang R,Stefanie A,Chambers Q J.Flower-like selfassembly of gold nanoparticles for highly sensitive electrochemical detection of chromium(VI)[J].Anal.Chim.Acta,2012,722:1～7.

[5]Sumida T,Sabarudin A,Oshima M,et al.Speciation of chromium in seawater by ICP-AES with dual minicolumns containing chelating resin[J].Anal.Sci.,2006,22:161～164.

[6]Agrawal Y K,Sharma K R.Speciation,liquid-liquid ex-traction,sequential separation,preconcentration,transport and ICP-AES determination of Cr(Ⅲ),Mo(VI)and W(VI)with calix-crown hydroxamic acid in high purity grade materials and environmental samples[J].Talanta,2005,67:112～120.

[7]Threeprom J, Purachaka S, Potipan L.Simultaneous determination of Cr(Ⅲ)-EDTA and Cr(VI)by ion interaction chromatography using a C18 column[J].J.Chromatogr.A,2005,1073:291～295.

[8]Threeprom J,Meelapsom R,Som-Aum W.Simultaneous determination of Cr(Ⅲ)and Cr(VI)with prechelation of Cr(Ⅲ)using phthalate by ion interaction chromatography with a C-18 column[J].Talanta,2007,71:103～108.

[9]Priego-Capote F,Castro L D.Speciation of chromium by in-capillary derivatization and electrophoretically mediated microanalysis[J].J.Chromatogr.A,2006,1113:244～250.

[10]蔡燕燕，趙燕芳，李茹，等.光度法在鉻Cr(VI)測定中的研究進展[J].分析測試技術(shù)與儀器，2009，15(4):203～211.

[11]Paul B D,Martin K K,Maguilo J,et al.Effects of pyridinium chlorochromate adulterant(urine luck)on testing for drugs of abuse and a method for quantitative detection of chromium(VI)in urine[J].J.Anal.Toxicol.,2010,24:233～237.

[12]Zhang L J,Xu C L,Li B X.Simple and sensitive detection method for chromium(VI)in water using glutathionecapped CdTe quantum dots as fluorescent probes[J].Microchim.Acta,2009,166(1-2):61～68.

[13]Wang D P,Shiraishi Y,Hira T.A distyryl BODIPY derivative as a fluorescent probe for selective detection of chromium(Ⅲ)[J].Tetrahedron Lett.,2010,51(18):2 545～2 549.

[14]何樹華，何德勇.NBS-熒光素化學(xué)發(fā)光體系測定頭孢吡肟和頭孢克肟[J].四川師范大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版)，2008，31：350～352.

[15]Azmi S N,Iqbal B,Al-Humaimi S H,et al.Quantitative analysis of cefixime via complexation with palladium(Ⅱ)in pharmaceutical formulations by spectrophotometry[J].J.Pharm.Anal.,2013,3(4):248～256.

[16]Pillai M S,Latha S P.Designing of some novel metallo antibiotics tuning biochemical behaviour towards therapeutics:Synthesis,characterisation and pharmacological studies of metal complexes of cefixime[J].J.Saudi Chem.Soc.,2012,in press(http://dx.doi.org/10.1016/j.jscs.2012.09.004).

[17]Ganjalia M R,Naji L,Poursaberi T,et al.Ytterbium(Ⅲ)-selective membrane electrode based on cefixime[J].Anal.Chim.Acta,2003,475:59～66.

[18]陳國慶，朱拓，虞銳鵬，等.甲醇溶液的熒光光譜特性[J].光電工程，2005，32(6):31～34.