注射HBsAg-SCT質(zhì)粒的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的檢測(cè)分析

鄧玉紅袁 靜徐六妹

（1 深圳市第三人民醫(yī)院預(yù)防保健科，廣東 深圳 518112；2 深圳市第三人民醫(yī)院感染科，廣東 深圳 518112）

注射HBsAg-SCT質(zhì)粒的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的檢測(cè)分析

鄧玉紅1袁 靜2徐六妹2

（1 深圳市第三人民醫(yī)院預(yù)防保健科，廣東 深圳 518112；2 深圳市第三人民醫(yī)院感染科，廣東 深圳 518112）

目的研究注射HBsAg-SCT質(zhì)粒的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶水平的變化。方法選取遺傳背景相同的HBsAg陰性正常鼠30只作為正常對(duì)照組，HBV轉(zhuǎn)基因鼠30只為實(shí)驗(yàn)1組，注射HBsAg-SCT質(zhì)粒的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠30只為實(shí)驗(yàn)2組。采集各組小鼠在8周齡時(shí)的血液，用全自動(dòng)的生化分析儀檢測(cè)小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平。結(jié)果實(shí)驗(yàn)1組（HBV轉(zhuǎn)基因小鼠未注射HBsAg-SCT質(zhì)粒組）和實(shí)驗(yàn)2組（HBV轉(zhuǎn)基因小鼠注射HBsAg-SCT質(zhì)粒組）小鼠的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶與正常對(duì)照組比較，均顯著升高（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)1組小鼠的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶與實(shí)驗(yàn)2組比較，無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論注射HBsAg-SCT質(zhì)粒的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平明顯高于正常小鼠；但與未注射HBsAg-SCT質(zhì)粒HBV轉(zhuǎn)基因小鼠無(wú)明顯差異。

HBV轉(zhuǎn)基因小鼠；HBsAg-SCT質(zhì)粒；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶

主要組織相容性復(fù)合體基因（major histocompatibility complex，MHC）編碼許多與T細(xì)胞的抗原識(shí)別密切相關(guān)的組織相容抗原。MHC是人類的第6對(duì)染色體的一組連鎖的基因群，包括MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ，人的MHC稱為人白細(xì)胞抗原（HLA）?？乖仨毐┞对诩?xì)胞膜上并與HLA的特異性的糖蛋白結(jié)合，T細(xì)胞才能將其識(shí)別并清除。對(duì)疾病易感性的個(gè)體差異在很大程度上是由遺傳因素所決定，以MHC表達(dá)的免疫遺傳學(xué)基礎(chǔ)是限定HBV感染發(fā)展的重要因素[1，2]。本研究通過(guò)檢測(cè)注射HBsAg-SCT質(zhì)粒的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶水平，為該HBV轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生理、病理、藥理和毒理的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

①含有H-2IJd的真核表達(dá)載體（pIRES-Ld）由Lybarger Lonnie實(shí)驗(yàn)室保存，編碼HBV抗原表位肽S28-39（IPQSLDSWWTSL）寡核苷酸由亞利桑那大學(xué)合成。按文獻(xiàn)報(bào)道[3]的方法，人工合成兩端分別帶一小段DNA接頭的HBV表面抗原CTL表位肽（S29-38）的寡核苷酸片段，與兩端帶接頭的β2m寡核苷酸片段混合變性后自然冷卻到室溫使其發(fā)生退火，其后將混合物與pIRES-Ld進(jìn)行連接，形成HbsAg-S28-39·β2m·Ld單鏈復(fù)合物（HBsAg-SCT），并命名為HbsAg-SCT[4]。②選取遺傳背景相同的HBsAg陰性正常鼠30只（正常對(duì)照組），HBV轉(zhuǎn)基因鼠30只（實(shí)驗(yàn)1組）和注射HBsAg-SCT質(zhì)粒的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠30只（實(shí)驗(yàn)2組）。各為6～10周齡，雌雄各半，本部飼育，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK 2005-010。

1.2 試劑和儀器

丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)的檢測(cè)儀器是奧林巴斯AU400，試劑由申能公司提供。

1.3 方法

各組小鼠均眼眶內(nèi)眥采血，采血時(shí)周齡均為8周，采血后室溫放置2 h后3000 r/min離心5 min提取血清。用全自動(dòng)奧林巴斯AU400生化儀檢測(cè)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)1組（HBV轉(zhuǎn)基因小鼠未注射HBsAg-SCT質(zhì)粒組）和實(shí)驗(yàn)2組（HBV轉(zhuǎn)基因小鼠注射HBsAg-SCT質(zhì)粒組）小鼠的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶與正常對(duì)照組比較，顯著升高（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)1組小鼠的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶與實(shí)驗(yàn)2組比較，無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1和表2。

表1 各組小鼠的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的檢測(cè)結(jié)果

表2 各組小鼠的血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)1組與對(duì)照組比較有明顯差異（t=18.5455；P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)1組與對(duì)照組比較有明顯差異（t=20.6692；P＜0.01）；而實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2比較無(wú)明顯差異（t=1.2624；P值＞0.05）。

3 討 論

HBV轉(zhuǎn)基因小鼠是國(guó)內(nèi)進(jìn)行乙肝發(fā)病機(jī)制、藥物研發(fā)和疫苗研發(fā)的首選動(dòng)物模型，由小鼠的生殖特性可知[5]，雌性小鼠的性成熟期是5～7周；雄性小鼠的性成熟期是6～8周，本研究的采血時(shí)小鼠的周齡均為10周，此時(shí)期小鼠均已以育完全，其性激素水平和血液生理生化指標(biāo)也基本趨于穩(wěn)定，但動(dòng)物的血液生理生化指標(biāo)受動(dòng)物的品系、年齡、性別、營(yíng)養(yǎng)代謝等情況，及測(cè)定方法與儀器設(shè)備和樣品量大小的影響，其正常范圍的差異很大[6]。

本研究是將自構(gòu)建的pIRES-HBsAg質(zhì)粒分次注射到被HBV感染的轉(zhuǎn)基因小鼠中，研究HBsAg-SCT質(zhì)粒質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠感染HBV后免疫應(yīng)答，本研究結(jié)果顯示：HBV轉(zhuǎn)基因小鼠和注射HBsAg-SCT質(zhì)粒的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]；而實(shí)驗(yàn)1組小鼠的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶與實(shí)驗(yàn)2組比較，無(wú)明顯差異（P＞0.05），但本實(shí)驗(yàn)指標(biāo)較少，對(duì)注射HBsAg-SCT質(zhì)粒的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的血液生理生化全面分析有一定的影響，今后應(yīng)增加其正常的生理生化指標(biāo)監(jiān)測(cè)，以便全面了解注射HBsAg-SCT質(zhì)粒的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為該HBV轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生理、病理、藥理和毒理的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

[1] Vinod K,Lo Y,Hau P,et al.Soluble MICA and a MICA Variation as Possible Prognostic Biomarkers for HBV-Induced Hepatocellular Carcinoma[J].PLoS One,2012,7(9):e44743.

[2] 蔡剛,吳蓓穎,范臻佳,等.慢性乙型肝炎患者外周血抗原特異性細(xì)胞功能的初步分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2014,29(1):10-14.

[3] Huang CH,Peng S.Cancer immunotherapy using a DNA vaccine encoding a single-chain trimer of MHC class I linked to an HPV-16 E6 immunodominant CTL epitope[J].Gene Ther, 2005,12(15):1180-1186.

[4] 周伯平,張紅梅,陳心春,等.HBV細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原表位單鏈三聚體在真核細(xì)胞中的表達(dá)及其腺病毒載體的構(gòu)建[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2007,17(1):19-22.

[5] 何誠(chéng).實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2006:65.

[6] 鄭鳳嬌,劉光澤.HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血液生理生化指標(biāo)檢測(cè)分析[J].華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2011,25(4):292-294.

[7] DingC,Wei H,Sun R,et al.Hepatocytes protemic alteration and seroproteome analysis of HBV-transgenic mice[J].Protemics,2009,9 (1):87-105.

R512.6+<2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B class="emphasis_bold">2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1671-8194（2014）27-0066-022 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

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2005年廣東省深圳市科技社會(huì)公益科研項(xiàng)目（JH200507120847A）