花青素主要成分與HER-2激酶區(qū)的分子對接

羅麗萍，余小平，韓彬，陳祥燕，彭曉莉，陳瑋，周杰，李遂焰

1 西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031 2 成都醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生系，四川 成都 610500

近年來，天然植物化學(xué)物質(zhì)的健康防護(hù)作用越來越受到研究者們的重視，但其與細(xì)胞相互作用的銜接位點(diǎn)研究較少，特別是化合物成分如何與靶點(diǎn)作用發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)不甚明了，該問題一直困擾諸多研究者。此外，天然植物提取物成分復(fù)雜，傳統(tǒng)試驗(yàn)方法在篩選有效成分方面費(fèi)時耗力，周期長成本高，利用各種生物信息學(xué)方法進(jìn)行新藥研發(fā)和靶點(diǎn)預(yù)測已經(jīng)成為熱點(diǎn)[1-3]。

MVD采用MolDock的演算法來預(yù)測小分子配體和大分子蛋白的相互作用，能夠根據(jù)配體準(zhǔn)確預(yù)測大分子蛋白的活性位點(diǎn)，是一款精確半柔性分子對接程序，通過增加限定條件，其對結(jié)合模式的識別有較好的準(zhǔn)確度[4]。與其他對接軟件相比，MVD對活性位點(diǎn)預(yù)測的準(zhǔn)確率較高 (MVD：87%, Glide： 82%, Surflex： 75%, FlexX： 58%)[5]。

人表皮生長因子受體 HER-2，又稱 ErbB-2或Neu，基因位于染色體17q21.1，其過表達(dá)可導(dǎo)致多種惡性腫瘤 (如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌等) 的發(fā)生，且患者預(yù)后差[6]?；ㄇ嗨貙儆邳S酮類化合物，大量研究表明，花青素能通過阻斷 HER-2受體信號傳導(dǎo)發(fā)揮抗癌作用，是潛在的HER-2靶向治療聯(lián)用藥物[7-9]，但其如何與HER-2受體作用尚不明確。目前已發(fā)現(xiàn)27種天然存在的花青素苷元 (Anthocyanidin或Aglycone)，其中6種 (結(jié)構(gòu)見圖1) 較常見：矢車菊色素 (Cyanidin,Cy)、飛燕草色素(Delphinidin,Dp)、錦葵色素 (Malvidin,Mv)、天竺葵色素 (Pelargonidin,Pg)、芍藥色素(Peonidin,Pn) 和牽?；ㄉ?(Petunidin, Pt)；此外，由于花青素苷元性質(zhì)活潑不穩(wěn)定，常與葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖等結(jié)合形成花色苷[10]。

本研究利用生物信息學(xué)方法對花青素中主要抗癌活性成分與HER-2酪氨酸激酶區(qū)進(jìn)行對接，試圖闡明二者相互作用機(jī)制，為研究該類化合物發(fā)揮抗癌作用的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受體晶體結(jié)構(gòu)

以人HER-2同源二聚體激酶結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu) (PDB ID： 3PP0, MMDB ID： 89546)[11]為基礎(chǔ)，選擇單體A作為計(jì)算機(jī)分子對接的受體模型，使用Molegro Virtual Docker 5.5 (MVD)軟件進(jìn)行對接研究。

1.1.2 配體三維結(jié)構(gòu)

六種花青素苷元及其對應(yīng)的單葡糖苷 (-G)及 ATP共 13種化合物的三維結(jié)構(gòu)文件，均從PubChem Compound (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/) 上下載，CID號分別為：花青素苷元：Cy (128861)，Dp (128853)，Mv (159287)，Pg(440832)，Pn (441773)，Pt (441774)；花青素單葡糖苷：Cy-G (441667)，Dp-G (443650)，Mv-G(443652)，Pg-G (443648)，Pn-G (443654)，Pt-G(443651)；ATP (UNX_0)。

1.1.3 細(xì)胞和試劑

人乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-453 (HER-2高表達(dá)) 購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。黑米花青素BRA-90 (Black Rice Anthocynins, BRACs) 購自吉林新星天然植物開發(fā)有限責(zé)任公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自TBD公司。RIPA (強(qiáng)) 裂解液購自碧云天生物科技研究所。兔抗人磷酸化HER-2多克隆抗體、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體分別購自美國Bioworld和北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 對接程序

采用 Molecular Virtual Docker 5.5(http：//www.molegro.com/mvd-product.php) 軟件，以HER-2激酶區(qū) (HER-2 receptor tyrosine kinase domain, HER2TK, 氨基酸序列：706–993)單體A全域進(jìn)行對接，檢測活性位點(diǎn)數(shù)設(shè)為10，采用標(biāo)準(zhǔn)MVD對接程序進(jìn)行分子對接。對接范圍采用球形，半徑 15?，其他參數(shù)默認(rèn)。將得到的配體構(gòu)象進(jìn)行成簇分析(成簇參數(shù)為0.5 ?)，然后基于對接的分子能量對各種結(jié)合模式進(jìn)行MolDock評分，最后依據(jù)成簇情況和最低MolDock Score來選取合理的對接結(jié)果。氫鍵供體-受體間的最大距離為0.30 nm[12]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及Western blotting

MDA-MB-453細(xì)胞用RPMI 1640 (含10%胎牛血清) 培養(yǎng)基，在37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。用RIPA裂解液提取經(jīng)BRACs(0、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL) 處理后細(xì)胞總蛋白。BCA法測定蛋白樣品濃度后，與5×上樣緩沖液混勻，煮沸5 min，每孔上樣100 μg，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%BSA室溫封閉2 h，加1∶500一抗于4 ℃孵育過夜；次日，TBST漂洗10 min，重復(fù)漂洗4次后，加入1∶5 000二抗室溫孵育2 h，TBST漂洗10 min，重復(fù)漂洗4次后，化學(xué)發(fā)光顯色，暗室壓片曝光，常規(guī)程序顯影、定影，晾干底片后掃描條帶圖像，以 Quantity One 軟件進(jìn)行條帶光密度值分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以±s表示，采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較使用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 花青素苷元與HER-2激酶區(qū)的分子對接

圖1 花青素苷元基本化學(xué)結(jié)構(gòu)[13]Fig. 1 Chemical structures of anthocyanidins[13].

花青素的基本結(jié)構(gòu)單元是 3,5,7-三羥基-2-苯基苯并吡喃型陽離子 (圖 1)，能選擇性作用于 HER-2受體激酶區(qū) (圖 2)。對接發(fā)現(xiàn)，6種花青素苷元都能結(jié)合在HER2TK區(qū)同一活性腔中，且MolDock Score都低于–100 kJ/mol，相互作用值 (Interaction) 低于–125 kJ/mol，表明對接結(jié)果良好，可用于后續(xù)研究 (表1)。

以Cy與HER2TK對接結(jié)果為例，圖3展示了最適構(gòu)象結(jié)合位點(diǎn)的微環(huán)境，Cy分子處于Val734、Ala751、Leu755、Ile767、Ala771、Met774、Leu785、Leu796、Leu852、Phe864等疏水氨基酸形成的疏水腔中，可產(chǎn)生較強(qiáng)的輸水作用；另一方面，Ile767、Glu770、Ser783、Thr798、Thr862等氨基酸與 Cy之間還有氫鍵作用；帶正電的Lys753還能與帶微弱負(fù)電荷的酚羥基相互作用。綜合分析，花青素苷元與HER2TK結(jié)合的主要驅(qū)動力是疏水作用力和氫鍵，靜電作用力較弱。

2.2 花青素單葡糖苷與 HER-2激酶區(qū)的分子對接

圖 4顯示，6種花青素單葡糖苷均結(jié)合在HER2TK的同一活性腔中，且與苷元結(jié)合的活性腔相同。此外，MolDock Score都低于–130 kJ/mol，相互作用值低于–150 kJ/mol，表明對接結(jié)果良好 (表 2)。

圖2 花青素苷元與HER2TK對接最適構(gòu)象Fig. 2 Optimum conformations of HER2TK docking with anthocyanidins.

表1 花青素苷元與HER2TK對接最適構(gòu)象參數(shù)Table 1 Optimum parameters of HER2TK docking with anthocyanidins

圖3 Cy與HER2TK對接最適構(gòu)象微環(huán)境Fig. 3 Microenvironment around binding site of Cy and HER2TK.

Supported by：National Natural Science Foundation of China (No. 81273047), Research Fund of Chengdu Medical School (No.CYZ12-015), Discipline Construction Project of Chengdu Medical College (No. CYXK2012010).

Corresponding author：Suiyan Li. Tel： +86-28-87600185; E-mail： suiyanli_@163.com

國家自然科學(xué)基金 (No. 81273074)，成都醫(yī)學(xué)院科研基金 (No. CYZ12-015)，成都醫(yī)學(xué)院學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目 (No. CYXK2012010) 資助。

圖4 花青素單葡糖苷與HER2TK對接最適構(gòu)象Fig. 4 Optimum conformations of HER2TK docking with anthocyanidins-glc.

以Cy-G與HER2TK對接結(jié)果為例，圖5展示了最適構(gòu)象結(jié)合位點(diǎn)的微環(huán)境，Cy-G分子處于 Leu726、Gly727、Gly729、Val734、Ala751、Ile752、Leu796、Leu800、Met801、Pro802、Gly804、Cys805、Leu852等疏水氨基酸形成的疏水腔中，疏水作用較強(qiáng)；另一方面，Leu726、Ser728、Ala751、Lys753、Leu796、Thr798、Cys805、Arg849、Asn850、Thr862、Asp863等氨基酸與Cy-G之間還能產(chǎn)生很強(qiáng)的氫鍵作用；帶正電的 Lys753、Arg849還能與帶微弱負(fù)電荷的酚羥基相互作用。綜合分析，花青素單葡糖苷與 HER2TK的主要驅(qū)動力是疏水作用力和氫鍵，靜電作用力較弱。

2.3 花青素對HER2TK的競爭性抑制機(jī)制

為進(jìn)一步分析花青素對 HER2TK的抑制機(jī)制，我們將HER2TK的底物，即ATP也進(jìn)行了對接，其MolDock Score為-161 kJ/mol，低于花青素苷元和單葡糖苷。

圖 6和圖 7分別為 Cy/HER2TK和Cy-G/HER2TK與 ATP/HER2TK結(jié)合位點(diǎn)的比較，比較發(fā)現(xiàn)，三者均在同一活性腔中且存在明顯競爭性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，能與 ATP形成氫鍵的氨基酸有 Ser783、Thr798、Met801、Arg849、Asn850、Thr862、Asp863，結(jié)合 2.1和 2.2的對接結(jié)果可知，Cy可能干擾ATP與Ser783、Thr798、Thr862間氫鍵的形成；而Cy-G可能阻礙ATP與Arg849、Asn850、Asp863間氫鍵的形成。

2.4 黑米花青素對HER-2磷酸化水平的影響

為驗(yàn)證花青素能否競爭性抑制 HER-2的磷酸化，我們用不同濃度BRACs對HER-2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株進(jìn)行處理。Western blotting結(jié)果顯示，BRACs能顯著抑制 HER-2的磷酸化(P<0.05)，且有劑量依賴性 (圖8)。

表2 花青素單葡糖苷與HER2TK對接最適構(gòu)象參數(shù)Table 2 Optimum parameters of HER2TK docking with anthocyanidins-glc

Received：June 28, 2013; Accepted： October 29, 2013

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網(wǎng)絡(luò)出版時間：2013-11-05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20131105.1011.001.html

圖5 Cy-G與HER2TK對接最適構(gòu)象微環(huán)境Fig. 5 Microenvironment around binding site of Cy-G and HER2TK.

圖6 ATP和Cy與HER2TK對接最適構(gòu)象比較Fig. 6 Comparison of interaction between HER2TK and Cy against ATP. Purple： Cy; Brown： ATP.

圖7 ATP和Cy-G與HER2TK對接最適構(gòu)象比較Fig. 7 Comparison of interaction between HER2TK and Cy-G against ATP. Purple： Cy-G; Brown： ATP.

圖8 Western blotting (A)和光密度分析法(B)檢測BRACs處理后HER-2磷酸化水平變化Fig. 8 HER-2 phosphorylation level variation after BRACs treatment by Western blotting technology (A)and optical density analysis (B). N=3; *： P <0.05, ***：P <0.001.

3 討論

分子對接方法在藥物研究領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，為先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化提供了有效的工具：研究小分子探針與細(xì)胞內(nèi)生物大分子的結(jié)合機(jī)制，確認(rèn)小分子在生物體內(nèi)的作用靶點(diǎn)，指導(dǎo)和解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，為新藥開發(fā)尋找新的突破口；以結(jié)構(gòu)生物學(xué)為基礎(chǔ)，進(jìn)行藥物與靶標(biāo)蛋白相互作用的動力學(xué)模擬研究，充分利用現(xiàn)有天然植物化學(xué)物質(zhì)中有效成分，經(jīng)修飾和優(yōu)化，設(shè)計(jì)具有更高活性的先導(dǎo)化合物，較好的軟件成功率高達(dá) 70%–80%[14-16]。Chalopin等[17]用分子對接方法發(fā)現(xiàn)Dp能直接與ERα的激活位點(diǎn)作用，促進(jìn)血管擴(kuò)張，證明紅酒多酚尤其是Dp對心血管疾病有防護(hù)效應(yīng)。與袁江蘭等[18]利用AUTODOCK 3.05分子對接軟件探究了染料木黃酮與EGFR-TK (EGFR酪氨酸激酶區(qū)) 的結(jié)合作用，發(fā)現(xiàn)染料木黃酮能通過干擾TK催化活性結(jié)構(gòu)中 Lys721/Glu738離子對的形成而抑制了EGFR-TK的活性，且屬于非競爭性結(jié)合。

HER-2是分子量約138 kDa的受體膜蛋白，其過度表達(dá)能引起HER-2同源二聚體的形成，引發(fā)不受配體激活的自發(fā)磷酸化，導(dǎo)致下游促癌信號通路持續(xù)性激活；還能通過 INTERNET(Integral trafficking from the ER to the nuclear envelope transport, 從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到核膜的整合轉(zhuǎn)運(yùn))途徑轉(zhuǎn)運(yùn)入核，參與COX-2、rRNA等基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，使細(xì)胞周期紊亂，轉(zhuǎn)移增加，并引發(fā)藥物耐受[19-20]。HER-2含一個胞外EGF相關(guān)的配體結(jié)合區(qū)，一個跨膜螺旋區(qū)，一個胞內(nèi)區(qū)，包括酪氨酸激酶區(qū)和 C-端調(diào)控區(qū)，本研究選擇HER-2的激酶區(qū)作為對接受體，因該區(qū)域含ATP結(jié)合位點(diǎn)，為激活下游信號通路所必需。

作為天然植物多酚化合物，花青素具有較強(qiáng)的健康促進(jìn)作用而倍受腫瘤學(xué)家和營養(yǎng)學(xué)家的關(guān)注。已有研究表明，花青素是酪氨酸激酶 (Protein tyrosine kinase, PTK) 的抑制劑[13]，能通過抑制HER-2的激酶活性發(fā)揮抗癌效應(yīng)，且具有無毒、不致畸、不致癌、不致敏、不致突變等特性[21]，但因其作用位點(diǎn)不明確阻礙了研發(fā)。在植物體內(nèi)，花青素很少以游離狀態(tài) (苷元) 存在，在花色苷合成酶催化合成的極短時間內(nèi)，易在C環(huán)3-位被類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶糖基化，與單糖或多糖結(jié)合形成穩(wěn)定的花青素，再轉(zhuǎn)運(yùn)至酸性液泡中發(fā)揮作用[22]，其在人體內(nèi)的吸收亦受糖苷配基的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響[23]。因此，本研究選擇花青素苷元和對應(yīng)單葡糖苷進(jìn)行對接研究。

Received：June 28, 2013; Accepted： October 29, 2013

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對接結(jié)果表明，6種花青素苷元及其單葡糖苷均能在同一活性腔與 HER2TK結(jié)合，但后者的結(jié)合能更低，可能是糖基增加了氫鍵作用力。提示花青素與 HER2TK的結(jié)合位點(diǎn)主要取決于母核結(jié)構(gòu)，糖的結(jié)合可增加花青素與 HER-2激酶區(qū)結(jié)合的穩(wěn)定性。但花青素結(jié)合糖基的種類和數(shù)目對 HER-2激酶活性的抑制作用是否有規(guī)律還有待探究。

由分子對接結(jié)果，我們推測：花青素能競爭性與ATP結(jié)合于HER2TK同一活性腔，并干擾氫鍵的形成，且單葡糖苷的競爭結(jié)合能力強(qiáng)于苷元。由于ATP結(jié)合的穩(wěn)定性高于花青素，因而解釋了花青素發(fā)揮抗癌效應(yīng)時對正常細(xì)胞具有保護(hù)效應(yīng)[4-5,24-25]。值得注意的是，目前研究主要集中在豐度較高的Cy-G和Dp-G[4,16]，但本研究發(fā)現(xiàn)，Pt-G的結(jié)合能低于 ATP，具備很高的作為ATP小分子抑制劑開發(fā)的價(jià)值。

前有研究證實(shí)花青素主要抗癌活性成分Cy-G和Dp處理高表達(dá)HER-2乳腺癌細(xì)胞株后，均能抑制HER-2的磷酸化水平，但并不影響總HER-2含量[7,26]。本研究進(jìn)一步證實(shí)，黑米花青素能以劑量依賴方式抑制HER-2的磷酸化。該結(jié)果與推測結(jié)果一致：花青素能競爭性抑制HER-2和ATP結(jié)合，從而抑制HER-2的磷酸化激活，但并不影響總HER-2的表達(dá)水平。

綜上所述，該研究表明花青素中12種主要抗癌活性成分均能與 HER-2酪氨酸激酶區(qū)對接，且對ATP與HER-2的結(jié)合存在競爭性。該對接位點(diǎn)的信息對分析該類化合物抑制 HER-2酪氨酸激酶活性的分子機(jī)制提供了依據(jù)，有助于花青素等天然植物化學(xué)物質(zhì)用于腫瘤治療及相關(guān)藥物的研發(fā)。

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